一种用于抑制肿瘤细胞生长的基因表达元件及其应用

文档序号:8295017阅读:1186来源:国知局
一种用于抑制肿瘤细胞生长的基因表达元件及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤基因治疗技术领域,具体涉及一种用于抑制肿瘤细胞生长的基因 表达元件及其应用。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一,其治疗耗费了大量的医疗资源,手术、 化疗和放疗等常规方式的疗效和预后均不理想,因此,研宄探索新的癌症治疗方法具有重 要意义。
[0003] 新兴的肿瘤生物治疗方法目前已经在临床开始应用,对放化疗无效的恶性肿瘤的 治疗显示出其独特的优势,展现出了良好的应用前景。其中肿瘤基因治疗始终是肿瘤生物 治疗的主要方向之一。
[0004] 靶向性是肿瘤基因治疗一个非常重要的方面,即在特异性杀伤肿瘤细胞的同时对 正常细胞没有伤害。利用肿瘤特异性启动子,使目的基因只在肿瘤细胞内特异性表达而在 其它细胞中不表达,是靶向性基因治疗的主要手段之一。
[0005] 在靶基因的选择方面,目前的基因治疗研宄大都仅针对那些在正常和肿瘤细胞中 表达差异明显的个别靶基因(如失活的抑癌基因、异常激活的癌基因、过表达的抗凋亡基 因、各种microRNA等)。然而,肿瘤的发生发展涉及众多基因,仅仅针对一个或几个表达 差异的基因虽能在一定程度上纠正肿瘤细胞的某些恶性表型,显示出一定的体内外抑瘤效 应,但因针对个别靶基因的抑瘤效率以及载体导入的靶向性、目的基因表达的可调控性等 较多的问题而使这些基因治疗手段无法在临床上发挥更好的疗效,甚至大部分难以进入临 床。因此,探索、尝试新的提高基因治疗药物的靶向性和体内抑瘤的有效性的肝癌基因治疗 方法具有十分重要的意义。
[0006] 肿瘤细胞具有快速生长和增殖的特性,而任何细胞的增殖都需要经过染色体复制 这一细胞内独一无二的重要基本环节。通过抑制DNA聚合酶的表达,可以使肿瘤细胞无法 进行染色体复制,进而无法增殖。
[0007] 如公开号为CN 10168654A的中国专利公开了一种癌胚抗原阳性细胞革El基因表达 元件CPD,该基因表达元件导入CEA阳性的肿瘤细胞后,可以在细胞中表达针对DNA聚合酶 S催化亚基pl25的人工microRNA,抑制DNA聚合酶δ催化亚基P125的表达,进而影响 DNA复制,抑制细胞增殖。
[0008] 真核细胞中负责DNA合成的DNA聚合酶主要有α、δ、ε三种,而现有用于抑制 DNA聚合酶表达的肿瘤革El向性基因表达元件中,其携带的microRNA均革El向单一的DNA聚合 酶,其阻断DNA复制的效果不够理想。并且,仅仅阻断肿瘤细胞的增殖还不能杀死肿瘤细 胞,难以根治癌症。

【发明内容】

[0009] 本发明公开了一种用于抑制肿瘤细胞生长的基因表达元件,该基因表达元件不仅 能有效阻断肿瘤细胞增殖,还能诱导肿瘤细胞凋亡。
[0010] 一种用于抑制肿瘤细胞生长的基因表达元件,由第一表达框和第二表达框组成, 所述第一表达框由肿瘤特异性启动子、分别靶向DNA聚合酶α、δ、ε的三种mircoRNA序 列以及转录终止信号序列依次连接而成;所述第二表达框由肿瘤特异性启动子、凋亡因子 基因以及转录终止信号序列依次连接而成。
[0011] -方面,本发明以染色体复制必需的DNA聚合酶α、δ、ε三个酶基因为靶点,对 它们的表达同时进行有效抑制,使得肿瘤细胞因缺乏这三种DNA聚合酶而无法进行染色体 复制,进而无法增殖;另一方面,本发明利用凋亡因子促进停止增殖的肿瘤细胞凋亡,最终 达到较为彻底的基因治疗的目的。将mircoRNA和凋亡因子置于两个单独的表达框分别转 录,避免相互干扰。
[0012] 针对不同的肿瘤细胞,可以选择不同种类的肿瘤特异性启动子,如甲胎蛋白启动 子、癌胚抗原启动子或前列腺特异性抗原启动子。其中,甲胎蛋白启动子(AFP启动子)可 以靶向肝细胞性肝癌细胞,癌胚抗原启动子(CEA启动子)可以靶向CEA阳性的肠癌、肺癌 细胞,前列腺特异性抗原启动子(PSA启动子)可以靶向PSA阳性的前列腺癌细胞。
[0013] 当选用AFP启动子时,其核苷酸序列优选为如SEQ ID No. 1所示。该序列的AFP 启动子中包含人AFP基因的-4120至-3300区的增强子区域和-180至+1区的基本启动子 区域,其中,该增强子区域中带有多个肝细胞特异性转录因子结合位点,可以较大幅度地特 异地提高AFP启动子的表达效率。
[0014] 作为优选,靶向DNA聚合酶α的mircoRNA序列如SEQ ID No. 2所示,靶向DNA聚 合酶δ的mircoRNA序列如SEQ ID No. 3所示,祀向DNA聚合酶ε的mircoRNA序列如SEQ ID No. 4 所示。
[0015] 三种mircoRNA序列的表达顺序对其抑制效果基本无影响,mircoRNA的拷贝数增 加后,抑制效果略有增加但幅度不大,因此也没有必要增加拷贝数。
[0016] 所述凋亡因子基因可选用Caspase3、Caspase6、Caspase7或Granzyme B基因。
[0017] 作为优选,所述凋亡因子基因为Caspase3基因,其核苷酸序列如SEQ ID No. 5所 不O
[0018] 本发明还提供了携带有所述基因表达元件的表达载体。该表达载体可以是腺病毒 表达载体。
[0019] 本发明还提供了所述基因表达元件在制备肿瘤基因治疗药物中的应用。
[0020] 采用包含不同肿瘤特异性启动子的基因表达元件,可以针对性地制备相应的肿瘤 基因治疗药物。
[0021] 作为一种实施方式,本发明提供了一种肿瘤靶向性基因表达元件,其核苷酸序列 如SEQ ID No. 6所示,可用于制备抑制肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的 基因治疗药物。该序列中,第一表达框由AFP启动子、Caspasd基因以及串联连接的两个牛 生长激素基因多聚腺苷酸信号区BGH polyA依次连接而成;第二表达框由AFP启动子、串联 连接的分别靶向DNA聚合酶α、δ、ε的三种microRNA序列(miR-pol α - δ - ε )以及BGH polyA依次连接而成。
[0022] 与现有技术相比,本发明的有益效果为:
[0023] 本发明的基因表达元件一方面以染色体复制必需的DNA聚合酶α、δ、ε三个酶 基因为靶点,对它们的表达同时进行有效抑制,使得肿瘤细胞因缺乏这三种DNA聚合酶而 无法进行染色体复制,进而无法增殖;另一方面利用凋亡因子促进停止增殖的肿瘤细胞凋 亡,最终达到较为彻底的基因治疗的目的。
【附图说明】
[0024] 图IA为各表达测试载体对Hep3B细胞中DNA聚合酶α基因表达的mRNA水平的 抑制效果;
[0025] 图IB为各表达测试载体对H印3B细胞中DNA聚合酶δ基因表达的mRNA水平的 抑制效果;
[0026] 图IC为各表达测试载体对Hep3B细胞中DNA聚合酶ε基因表达的mRNA水平的 抑制效果;
[0027] 图 ΙΑ、IB、IC 中,Relative mRNA level 表不相对 mRNA 水平,Blank control 表不 空白对照,统计学检验* :Ρ〈〇· 05, # :ρ〈0· 01,# :ρ〈0· 001,下同;
[0028] 图2Α为腺病毒表达载体Ad/AFP-Casp-AFP-amiR的结构示意图;
[0029] 其中,Adenoviral backbone表示腺病毒骨架,AFP promoter表示重组AFP启动 子,rCaspase3表示组成型重组活化Caspase 3基因,miR-pola表示革[!向DNA聚合酶α的 人工miRNA,miR-pol δ表示靶向DNA聚合酶δ的人工miRNA,miR-pol ε表示靶向DNA聚 合酶ε的人工miRNA,polyA表示转录终止信号;下同;
[0030] 图2B为腺病毒表达载体Ad/AFP的结构示意图;
[0031] 图3A为不同肝细胞中甲胎蛋白AFP的mRNA水平;
[0032] 其中,Relative mRNA level 表不相对 mRNA 水平,HepG2、Hep3B 为肝癌细胞, HL7702为正常肝细胞;下同;
[0033] 图3B为各腺病毒表达载体对HepG2细胞中各DNA聚合酶mRNA水平的抑制效果;
[0034] 图3C为各腺病毒表达载体对H印3B细胞中各DNA聚合酶mRNA水平的抑制效果;
[0035] 图3D为各腺病毒表达载体对HL7702细胞中各DNA聚合酶mRNA水平的抑制效果;
[0036] 图4A为各腺病毒表达载体对HepG2细胞中DNA聚合酶蛋白水平的抑制效果;
[0037] 图4B为各腺病毒表达载体对Hep3B细胞中DNA聚合酶蛋白水平的抑制效果;
[0038] 图4C为各腺病毒表达载体对HL7702细胞中DNA聚合酶蛋白水平的抑制效果;
[0039] 图4A、4B、4C中,pol α表示聚合酶a,p〇l δ表
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