法尼烯合酶的制作方法
【专利说明】法尼烯合酶
[0001] 本申请是2009. 12. 02提交的CN 200980148985. X，题为"法尼烯合酶"的分案申 请。
【发明内容】
[0002] -种新的分离自番茄的法尼烯合酶。该法尼烯合酶形成的终末产物显示了令人惊 奇的性质，其基因在核苷酸水平上与已知的其它来源的法尼烯合酶基因序列相同性低。本 发明涉及分离的多核苷酸，由所述多核苷酸编码的多肽，基因构建物，携带这种多核苷酸、 多肽和基因构建物的载体、宿主、特别是植物，以及这种植物产生的种子。
技术领域
[0003] 本发明涉及法尼烯合酶，具体是α -法尼烯合酶和/或β -法尼烯合酶。也涉及 编码这些酶的多核苷酸序列。本发明也涉及掺入有该多核苷酸序列的核酸（或基因）构建 物，载体和宿主细胞。还涉及α-法尼烯和/或β-法尼烯的生产及其用途。
【背景技术】
[0004] 术语法尼烯指一组六种全部都是倍半萜烯的密切相关的化合物。α-法尼烯与β 法尼烯是异构体，彼此有一个双键位置不同。
[0005] ct _法尼稀是3, 7, 11-二甲基_1，3, 6, 10-十二碳四稀，β -法尼稀是7, 11-二甲 基-3-亚甲基-1，6, 10-十二碳三烯。α -法尼烯存在四种立体异构体，差别在于三个内部 双键中的两个几何学构型不同（第三个内部双键的立体异构体相同）。β-法尼烯存在中 央双键几何学构型不同的两种立体异构体。只是对于α-法尼烯与β-法尼烯各种异构体 之间的差异与这些异构体具体功能的关系认识有限。
[0006] α -法尼烯组成型存在于许多物种中或可被诱导（Gapper等，收获后生物学和 技术（Postharvest Biology and Technology)42: (2006)225-233)。据信 α-法尼稀由 二磷酸法尼酯（FDP)通过烃类中间物反应过程而合成，并报道受α法尼烯合酶的催化 (Rupasinghe，等，J. Am. Soc. Hortic. Sci. 123, 882-886 (1998))。
[0007] β-法尼烯广泛存在于各种各样的植物和动物中。已出版了各种关于这种天然 产物及其在化学通讯部署中作为重要信使的文献。β-法尼烯存在于许多裸子植物和被 子植物，包括母菊（Chamomilla recutita),葡萄（Vitis vinifera),玉米（Zea mays), 和胡椒（Piper nigrum)的精油中。（Ε)-β-法尼烯合酶是埃及棉花叶虫（Spodoptera Iittoralis)诱生的，该叶虫寄生在玉米壳和叶组织中，但不存在于根组织中（Schnee等， 植物生理学（Plant Physiol), 2002, 130:2049-2060)。β -法尼烯据信是由FDP通过涉及 二价金属离子辅助的二磷酸酯离子化，和产生的碳阳离子C-3甲基去质子化反应所合成， 参见W01999/18118中公开的内容。
[0008] 已描述的α-法尼烯功能是作为昆虫吸引剂，在小鼠和昆虫中起着性别信息素 作用。它在原鼻白蚁（Prorhinotermes canalifrons)中起着报警信息素作用（Sobotnik 等，（2008)化学生态学杂志J.Chem.Ecol.，34(4):478-86)。α-法尼烯及其衍生物的其 它用途是强效癌症预防剂，和用于塑料膜合成（US20060137032)。Herndindez-ceruelos等 (Toxicol. Lett. 135:103-110,2005)报道，甘菊精油的主要成分β-法尼烯在诱变处理小 鼠骨髓细胞时具有诱变作用）。
[0009] 据报道法尼烯是羽扇豆花粉气味的主要成分，能刺激黄蜂的授粉行为 (Dobson等，（1996) Am. J. Bot. 83, 877-885)。更最重要的是，已报道姆虫，例如棉虫牙 虫（Aphis gossypii)可利用β-法尼烯作为报警信息素（Jianwei等，2006, J. Econ. Entomol. 99 (5) :1636-1640 ;Kislow 和 Edwards, 1972，自然 Nature 235:108-109 ;Pickett 和 Griffiths, 1980, J. Chem. Ecol. 6:349-360)，绿桃虫牙虫（Myzus persicae) (Edwards, L J.，1973，自然241:126-127)接触β-法尼烯后变得不安，而从其寄生的植物驱散 (Wohlers (1981) Z Angew. Entomol. 92, 329-336)。β -法尼烯在 IOOng/ 蚜虫剂量时对 虫牙虫有急毒性（van Oosten 等（1990)Acta Phytopathol. Entomol. Hung. 25, 331-342)。 还感兴趣的是注意到β-法尼烯蒸气对粉風有毒性（Klijnstra等，（1992)Meded Fac. Landbouwwet. 57,485-491)。不幸的是，对庄稼局部施用β-法尼烯控制姆虫行为的努力极 少成功，因为其在空气中易挥发和迅速氧化失活。（Dawson等（1988) Pest. Sci. 22, 17-30)。
[0010] Schnee 等（植物生理学（Plant Physiology)，130 卷，2049 页（2002)描述了 一种三萜合酶，能催化形成（Ε)-β-法尼烯。W02004/035791公开了海棠家蝇（Malus domestica)的 α -法尼烯合酶。W099/18118 公开了椒样薄荷（Mentha piperita)的 (E) - β -法尼烯合酶。
【发明内容】
[0011]
[0012] 在第一个方面，提供了 SEQ ID NO: 1所示的多核苷酸和其同源物。该核苷酸编码 具有法尼烯合酶活性，具体是α-法尼烯合酶活性和/或β-法尼烯合酶活性的多肽。
[0013] 在另一个方面，本发明提供了 SEQ ID Ν0:2所示的多肽和其同源物。该多肽具有 法尼烯合酶活性，具体是α-法尼烯合酶活性和/或β-法尼烯合酶活性。
[0014] 在另一个方面，本发明提供了基因构建物，含有该基因构建物的载体，和含有该基 因构建物的宿主细胞，其中所述基因构建物含有本发明的多核苷酸。
[0015] 在另一个方面，本发明提供了含有这种基因构建物的转基因植物或植物细胞，以 及这种植物或植物细胞产生的种子。
[0016] 在另一个方面，提供了制备α-法尼烯和/或β_法尼烯的方法，包括利用本发明 的多核苷酸。
[0017] 在还有一个方面，提供了一种调节植物中α -法尼烯和/或β -法尼烯产生的方 法，包括调节本发明多核苷酸编码的多肽的表达水平。
[0018] 参见下面的详述和实施例，结合附图的描述和实施例中的说明，将会更容易理解 本发明的上述方面和其它优点。
[0019] 定义
[0020] 在以下描述和实施例中，使用了一些术语。为了提供对本说明书和权利要求书的 清楚和一致的理解，提供了以下定义，包括这些定义给出的范围。除非另外有定义，本文所 用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。所有 出版物、专利申请、专利和其他文献的公开内容都在本文中完整引用以供参考。
[0021] "法尼烯合酶"指能将二磷酸法尼酯转变成α -法尼烯和/或-法尼烯的酶。
[0022] "法尼烯合酶活性"指本发明的法尼烯合酶催化二磷酸法尼酯形成α-法尼烯、 β_法尼烯或两者的酶活性。可用酶活性试验，例如实施例所述的试验测定活性。本发明法 尼烯合酶的氨基酸序列变体可具有所需的改变的生物学活性，包括例如，改变的反应动力 学，底物利用度，产物分布或其它性质，例如立体化学性质。
[0023] "基因构建物"指多核苷酸分子，通常是双链DNA，其中可插入另一个多核苷酸分子 (插入性多核苷酸分子），例如但不限于cDNA分子。基因构建物可含有允许转录该插入性 多核苷酸分子，以及任选的将该转录物翻译成多肽所必需的元件。此插入的性多核苷酸分 子可衍生自宿主细胞，或可衍生自不同细胞或生物，和/或可以是重组多核苷酸。一旦位于 宿主细胞内，该基因构建物可整合入宿主染色体DNA中。该基因构建物可与载体相连接。
[0024] 术语"基因"指含有能在细胞内转录成RNA分子（例如mRNA)，与合适的调控区（例 如启动子）操作性连接区域（转录区）的DNA序列。因此基因可以包含多个操作性连接 的序列，例如启动子、5'前导序列（其包含例如参与翻译起始的序列）、（蛋白质）编码区 (cDNA或基因组DNA)和3'非翻译序列（包含例如转录终止位点）。
[0025] "宿主细胞"指原核或真核细胞。典型的原核宿主细胞包括大肠杆菌的各种菌株。 典型的真核宿主细胞有植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞。
[0026] "序列相同性百分数"意味着当两条氨基酸序列或两条核酸序列排列对齐时，占据 同一相应位置的氨基酸或核苷酸的百分数。要比较序列长度的核酸通常是至少120个核苷 酸，优选200个核苷酸，更优选的300个核苷酸组成的核酸。要比较序列长度的多肽通常是 至少40个氨基酸残基，优选65个氨基酸残基，更优选100个氨基酸残基组成的多肽。优选 用Clustal W排列比对法测定"序列相同性百分数"。可用CLC Bio, Cambridge, MA，USA的 软件程序"CLC Free Workbench 3"进行vClustalW排列比对。该程序可从网站http: // www. clcbio. com上免费得到。核苷酸和氨基酸排列比对所用的参数是：缺口开放罚10分， 缺口延伸罚1分。缺口末端与所有其它缺口相同对待。
[0027] 本文所用的"多核苷酸"指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合 物，包括DNA和相应的RNA分子，可以是有义或反义取向，考虑包括cDNA、基因组DNA和重组 DNA，以及完全或部分合成的多核苷酸。多核苷酸可由整个基因或其任一部分组成。操作性 反义多核苷酸可包