诊断基因甲基化的探针组及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因检测领域，更具体地，本发明涉及诊断基因甲基化的探针组及其 应用。
【背景技术】
[0002] DNA甲基化是基因表观修饰方式之一，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能 关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。哺乳动物中，DNA的甲基 化仅发生于CpG的胞嘧啶上，在DNA甲基化转移酶（DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'端 的胞嘧啶转变为5'甲基胞嘧啶（ mC)。这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它可以 调控基因的表达。DNA甲基化是研宄最为深入的表观遗传学机制，其在维持正常细胞功能、 染色质结构修饰、X染色体失活、基因组印迹、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。
[0003] 哺乳动物基因组中的CpG序列出现的频率仅有1%左右，远低于基因组中的其它 双核苷酸序列。但在某些区域中，CpG序列密度很高，可以达均值的5倍以上，成为胞嘧啶 和鸟嘌呤的富集区，形成所谓的CpG岛。CpG岛通常位于基因的启动子区或是第一个外显子 区。健康人基因组中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态，而在CpG岛外的CpG 位点则通常是甲基化的。当肿瘤发生时，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，以至于染色 体螺旋程度增加及抑癌基因表达的丢失。
[0004] 目前研宄DNA甲基化的方法主要有：1.甲基化敏感性内切酶法；2.重亚硫酸盐 (Bisulfite)修饰法；3.特异性识别甲基化抗体分析法；4.质谱或色谱分析法等。其中重 亚硫酸盐修饰法是目前应用最为广泛的CpG甲基化检测方法。该方法采用Na 2S2O5处理样 本DNA，将未发生甲基化的C转化为U，而发生甲基化的 mC保持不变；经过PCR扩增后，U转 变为T，而mC转变为C，从而使基因组上的甲基化/非甲基化转变为C/T (Y)多态性，通过检 测目标位点上的C/T状态，可以确定是否存在基因的甲基化。
[0005] 基于重亚硫酸盐修饰的甲基化检测方法多种多样，比如BSP克隆测序法、荧光PCR 法、芯片杂交法等。其中荧光PCR法和芯片杂交法都需要通过特异性的甲基化探针和非甲 基化探针来识别目标位点的甲基化状态。对于目标区段完全甲基化和完全非甲基化的样 品，常规的甲基化探针和非甲基化探针可以有效地加以鉴别。由于生物样品本身的复杂性， 很多样本中存在不完全甲基化的状态，它们的重亚硫酸盐修饰产物既不能与甲基化探针完 全配对，又不能与非甲基化探针完全配对，按常规设计的甲基化探针不能有效检测出此类 样本。
[0006] 因此，需要开发新的基因甲基化探针设计方法，以便更加全面、有效地检测基因的 甲基化状态。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供诊断基因甲基化的探针组及其应用。
[0008] 在本发明的第一方面，提供一种制备检测基因甲基化的探针的方法，所述的方法 包括：
[0009] (1)根据待测基因经过重亚硫酸盐处理后的甲基化区域序列，设计与该区域完全 互补的基础探针；
[0010] (2)用脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基（I)替换基础探针中部分与待测基因经过重亚硫 酸盐处理后的甲基化区域中甲基化胞嘧啶（ mC)相配对的鸟嘌呤碱基（G);根据甲基化胞嘧 啶所在位置，合成多条（包括2-6条）探针，每一探针上脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基所在位置 不同。
[0011] 在一个优选例中，步骤（2)合成：探针组1，其中包括：
[0012] 探针a，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟 嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按G-I-G-I…顺序排布；和
[0013] 探针b，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟 嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按I-G-I-G…顺序排布。
[0014] 在另一优选例中，步骤（2)合成探针组2,其中包括：
[0015] 探针c，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟 嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按G-G-I-I…顺序排布；
[0016] 探针d，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟 嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按G-I-I-G···顺序排布；
[0017] 探针e，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟 嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按I-I-G-G…顺序排布；和
[0018] 探针f，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟 嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按I-G-G-I…顺序排布。
[0019] 在另一优选例中，所述的探针的长度为15-60个碱基；较佳地为20-40个碱基（如 25个，30个，35个碱基）。
[0020] 在另一优选例中，所述探针针对待测基因的甲基化区域中4-10甲基化胞嘧啶 (mC);较佳地，所述探针针对待测基因的甲基化区域中4-7个甲基化胞嘧啶（ mC)。
[0021] 在另一优选例中，所述的基因是06-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶基因，所述的探 针是核苷酸序列如SEQ ID NO:3?SEQ ID NO:8所示的探针。
[0022] 在另一优选例中，所述的探针还携带有可检测标记物，较佳地为荧光标记物。
[0023] 在本发明的另一方面，提供一种非诊断性地检测基因甲基化的方法，所述方法包 括：
[0024] (i)以所述的方法制备检测基因甲基化的探针；所述的探针还携带有可检测标记 物；
[0025] (ii)以经过重亚硫酸盐处理后的基因样本，采用PCR法、基因芯片法或膜杂交法 检测探针与该基因样本的结合情况，从而获得待测基因的甲基化情况。
[0026] 在一个优选例中，所述的可检测标记物是荧光标记物，步骤（ii)中，利用能扩增 出待测基因经过重亚硫酸盐处理后的甲基化区域的引物对以及（i)的探针进行荧光PCR法 检测，从而获得待测基因的甲基化情况。
[0027] 在本发明的另一方面，提供一种检测基因甲基化的试剂盒，所述的试剂盒中包括： 根据所述的方法制备的探针；较佳地，包括：
[0028] 探针组1，其中包括：探针a，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化 位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按G-I-G-I…顺序排布；探针b，以 针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄 嘌呤核苷酸即I按I-G-I-G…顺序排布；和/或
[0029] 探针组2,其中包括：探针c，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化 位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按G-G-I-I…顺序排布；探针d，以 针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄 嘌呤核苷酸即I按G-I-I-G…顺序排布；探针e，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针 对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按I-I-G-G…顺序排布； 探针f，以针对甲基化位点的碱基计数，从第1个针对甲基化位点的碱基起算，鸟嘌呤即G和 脱氧次黄嘌呤核苷酸即I按I-G-G-I…顺序排布。
[0030] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0031] 图1、本发明的甲基化探针设计示意图。
[0032] 图2、本发明探针鉴别完全甲基化/非甲基化样本。
[0033] 图3、本发明探针和1个非甲基化位点的结合。
[0034] 图4、本发明探针和2个非甲基化位点的结合。
[0035] 图5、采用三种荧光PCR体系，分别扩增：〇完全甲基化样本、@含1个非甲基化 位点的部分甲基化样本、?含2个非甲基化位点的部分甲基化样本和?非甲基化样本的荧 光扩增曲线。
【具体实施方式】
[0036] 本发明人经过深入的研宄，揭示了一种优化的基因甲基化探针制备方法，通过在 甲基化探针的特定位置引入脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基（I)，得到优化的甲基化检测探针，其 既能够和完全甲基化的样本DNA结合，又能够容忍结合区段内存在1-2个非甲基化的位点， 从而有效提尚对不完全甲基化样本的检测效率。
[0037] 如本文所用，"样本"或"样品"需进行DNA甲基化状态检测的核酸物质，其可以来 自于个体（如人或动物），也可以是其它来源的，例如一些经扩增或未经扩增的实验室核酸 材料，或人工合成的测试品。应理解，对"样本"或"样品"的检测并非仅涉及诊断目的，还 可涉及其它非诊断目的。
[0038] 如本文所用，"互补"的序列通常是指将5' -3'方向的序列转换为其3' -5'方向的 序列（如5' ATCG 3' 一 GCTA)，然后再取其互补序列（如GCTA - 5' CGAT 3'）。
[0039] "互补"包括"基本上互补"，所述"基本上互补"是指两段核苷酸的序列是足够互补 的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构（如茎环结构）。通常，两条 "基本上互补"的核苷酸序列互相之间至少有70%的碱基是互补的；优选的，至少有80%的 喊基是互补的；更优选的，至少有90%的喊基是互补的；