酮醇酸还原异构酶及其使用方法
【专利说明】
[0001] 政府许可权利
[0002] 本发明是在根据美国能源部批准的协议DE-AR0000006的政府支持下作出的。政 府拥有本发明中的某些权利。
技术领域
[0003] 本发明涉及包含酮醇酸还原异构酶活性的多肽、编码此类多肽的多核苷酸、包含 此类多核苷酸和多肽的宿主细胞、和使用此类组合物的方法。
[0004] 相关专利申请的夺叉引用
[0005] 本专利申请涉及并要求提交于2012年5月11日的美国临时专利申请号 61/645, 832和提交于2013年3月15日的美国临时专利申请号61/787, 480的优先权，上述 文献均全文以引用方式并入本文。
[0006] 引用经由Efs-Web以电子方式涕夺的序列表
[0007] 以电子方式同此提交的序列表的内容（文件名：20130510_CL5631W0PCT_ SEQLIST.txt ;大小：1,319,613字节；创建日期：2013年5月10日）全文以引用方式并入 本文。
【背景技术】
[0008] 酮醇酸还原异构酶（KARI)参与缬氨酸和异亮氨酸的生物性生产。KARI酶还已 被显示对于利用工程化的微生物生产异丁醇的途径是有用的（美国专利7, 851，188和 7, 993, 889)。此类微生物能够被用于从植物来源的底物生产异丁醇。
[0009] 虽然用于异丁醇的化学合成的方法是已知的（羰基合成、一氧化碳的催化氢化 (Ullmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第 6 版，2003,Wiley-VCH Verlag GmbH and Co.，Weinheim，Germany，第5卷，第716-719页）和甲醇与正丙醇的格尔伯特缩 合（Carlini 等人，J. Molec. Catal. A. Chem. 220 :215-220, 2004)，但这些工艺利用来源于石 油化学品的起始材料，通常是昂贵的。此外，异丁醇的化学合成不具有环境优势（诸如使温 室气体排放最小化）的潜能。用植物来源的原材料生产异丁醇将代表本领域的进步。
[0010] 能够利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH)的KARI酶能够在通常使用的微生 物细胞中利用通过现有的糖酵解途径和其他代谢途径产生的NADH，并可导致改善的异丁醇 生产。美国专利8, 129, 162和美国专利申请公开2010/0197519A1描述了具有利用辅因子 (NADH)的不同能力的KARI酶的生成。然而，本领域仍然存在对具有适用于诸如异丁醇生物 合成途径的生产途径的KARI活性的替代性多肽的需求。
【发明内容】
[0011] 本文提供了具有酮醇酸还原异构酶活性的多肽，其中在对应于SEQ ID NO :2的52 的位点处的氨基酸是D或E，并且其中所述多肽在下列区域中的一个中包含至少一种取代： 在分子间二聚体界面区域、结构域间界面区域、N-结构域表面螺旋区域、疏水性桥区域、或 C-末端尾区域中的至少一个处，其中所述至少一种取代是在对应于SEQ ID NO :2的113、 V53、A68、A69、A71、G72、V76、S86、L88、K99、Y113、N114、V117、I127、I152、S157、V171、M238、 Y239、E264、N267、A268、Q272、R275、A277、R280、Y286、I291、S292、A295、M301、R306、S322、 A329、K335或A336的位点处。在实施例中，所述多肽在位点L33、P47、F50、F61、I80或V156 中的至少一个处还包含取代。在实施例中，所述多肽包含与SEQ ID NO :2至少约80%、至 少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%的同一性。
[0012] 本文提供了多肽变体，所述多肽变体包含与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2至少约 80%的同一性、至少约85%、至少约90%、至少约95%、或至少约99%的同一性和在下列 位点中的至少一个处的取代：Y286、1152、S322、S292、1291、113、P47、F50、V53、A268、V76、 A336、L88、A71、G72、M301、Y239、Y113、N114、A329、A69、A295、E264、R280、S157、M238、Q272、 K335、K99、R275或R306。在实施例中，所述多肽具有酮醇酸还原异构酶活性。
[0013] 因此，本文提供了包含下列的多肽：（a)SEQ ID NO :3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、20、22、23、24、25、26、27、28、29、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、 69、70、71、72、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、 95、96、97、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、116、 118、119、120、121、123、124、128、129、131、132、133、134、136、137、138、139、140、141、142、 143、144、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、157、159、160、161、346、350、351、 352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、 371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381或382 的氨基酸序列；（b)与SEQIDN0: 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22、23、24、25、26、27、28、29、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、 61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、 110、111、112、113、114、116、118、119、120、121、123、124、128、129、131、132、133、134、136、 137、138、139、140、141、142、143、144、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、157、 159、160、161、346、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、 365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381 或 382 至少 约95%或至少约99%的同一性；或（c) (a)或（b)的活性片段。在一些实施例中，微生物宿 主细胞包含此类多肽。在一些实施例中，此类微生物宿主细胞产生异丁醇。
[0014] 本文提供的多肽包括具有酮醇酸还原异构酶活性且包含与SEQ ID NO :2至少 约85%、至少约95%、或至少约99%的同一性以及下列取代中的至少一种的多肽：Y286F、 A336R、I152V、S322A、S292A、I291V、或它们的组合；或此类多肽的活性片段。在实施例中， 所述多肽还包含下列取代中的至少一种：I13L、P47Y、F50A、V53A、A268E、V76I、A336G、L88V、 或它们的组合。在实施例中，多肽包含与SEQ ID N0:3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14、15、 16、17、18、20、22、23、24、25、26、27、28 或 29 95%或至少约 99%的同一性。
[0015] 本文提供的多肽包括具有酮醇酸还原异构酶活性且包含与SEQ ID NO :2至少 约85%、至少约95%、或至少约99%的同一性以及下列取代中的至少一种的多肽：Y286F、 A71K、G72W、A336R、I152V、A268T、A329E、或它们的组合；或此类多肽的活性片段。在实施例 中，多肽包含与 SEQ ID NO :33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63 或 64 至少约 95%或至少约 99%的同一性。
[0016] 本文提供的多肽包括具有酮醇酸还原异构酶活性且包含与SEQ ID NO :41至少 约85%、至少约95%、或至少约99%的同一性以及下列取代中的至少一种的多肽：M301I、 Y239H、Yl 13F、S322A、A71K、NI 14G、A329R、A69T、NI 14S、G72W、A295V、E264K、R280D、A329E、 51571^2381、02721\1(3351、1?280!1、或它们的组合；或此类多肽的活性片段。在实施例中，多 肽包含与 SEQ ID NO :99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、 114、116、118、119、120、121、123、124、128、129、131、132、133、134、136、137、138、139、140、 141、142、143、144、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、157、159、160 或 161 至少 约95%或至少约99%的同一性。在实施例中，具有酮醇酸还原异构酶活性的多肽包含SEQ 10勵：365、366、157、159、154、377、367、123、42或41的氨基酸序列。
[0017] 本文提供的多肽包括具有酮醇酸还原异构酶活性且包含与SEQ ID NO :346至少 约85%、至少约95%、或至少约99%的同一性以及下列取代中的至少一种的多肽：A68E、 I152V、Y286F、和 A336R。
[0018] 与SEQ ID NO :2或野生型酮醇酸还原异构酶相比，本文提供的多肽还可提高生物 合成途径的生产能力。生产能力的提高可包括所述途径的步骤的性能（诸如由酮醇酸还原 异构酶催化的反应的速率）的提高和/或对抑制的敏感性或底物竞争的降低。与诸如SEQ ID NO :2的不具有本文所述的修饰的多肽相比，生产能力的提高还可表现为产物收率的提 尚，例如提尚的异丁醇生广。生广能力的提尚可以为大约至少约1%、2%、3%、4%、5%、 6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%，40%、45%、50%至约 100%。
[0019] 在实施例中，在本文提供的多肽中，在对应于SEQ ID NO :2的位点52的位点处的 氨基酸是D或E。在实施例中，在对应于SEQ ID NO :2的位点24的位点处的氨基酸是F ;在 对应于SEQ ID NO : 2的位点33的位点处的氨