胎儿健康状态的无创性检测的制作方法
【专利说明】
[0001] 交叉参考相关申请
[0002] 本发明要求2012年7月31日为申请日，中国专利申请号为201210271283. 4,发明 名称为"用于确定胎儿健康状态的方法"的权益，该申请的全部内容为了所有目的通过引用 的方式并入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及用于确定胎儿的健康状态的无创性方法。具体地，本发明涉及通过在 来自怀孕女性的生物样本中评估与外源性生物体相关的生物标志物而用于检测胎儿健康 状态的方法。
【背景技术】
[0004] 具有侵入性程序的常规产前诊断方法，如绒毛膜绒毛取样和羊膜穿刺 术，对胎儿和母亲均具有潜在风险。可以采用孕妇血清标志物和超声波对胎儿 非整倍性进行无创性筛查，但其具有有限的灵敏度和特异性。Kagan等，Human R印roduction(2008)23:1968 - 1975;Malone 等，N Engl J Med(2005)353:2001 - 2011〇
[0005] 随着DNA测序技术的发展，无创性检测技术已经被广泛应用于某些疾病的临床诊 断，从而提供一种新的并且有效的方法。无细胞胎儿DNA可以在孕妇外周血中被检测到。Lo 等，Lancet 350:485487 (1997) ;Lo 等，Am. J. hum. Genet. 62:768-775 (1998)。尽管胎儿 DNA 的量在孕妇外周血中是低的，新一代的测序技术应经被成功地应用于检测针对胎儿疾病诊 断的基因异常。
[0006] 病毒、细菌、寄生虫、真菌和其他病原体感染怀孕女性后可以对胎儿产生不良后 果，如流产、死产、和出生缺陷。冯&沈，妇产科学，（人民卫生出版社，150-154页）。怀孕 期间一些常见的临床病原体感染为：HBV、HCV、HIV、TORCH(弓形虫、风瘆病毒、巨细胞病毒、 和单纯疱瘆病毒）、梅毒。
[0007] 目前，医院里常用的用于检测耶￥、!1(^、!11￥、1'(?01、和梅毒的方法主要是通过利用 基于酶联免疫吸附（ELISA)的方法检测怀孕女性的外周血中针对所述病原体的抗体而进 行评估的，从而间接反映所述怀孕女性的感染状态。这些方法对检测胎儿感染一般是无效 的。所述方法的一些局限性为：1)只有少数已知的病原体可以被检测到；2)每一个病原体 需要相应的抗体检测试剂；3)所需要的血液量随着所需检测的病原体的数量而增加；4)这 些方法非常耗时；以及5)这些方法不利于批量测试。
[0008] 基于酶联免疫吸附（ELISA)的方法最致命的缺陷在于其并不适合胎儿感染的判 断。例如，TORCH检测主要是通过以下而确定的：首先利用基于ELISA的方法评估孕妇外周 血中IgM和IgG，随后确定所述怀孕女性的感染状态并推断对所述胎儿的可能影响。确定胎 儿感染有时需要进一步的测试，如针对IgM检测的羊膜穿刺或胎儿核苷酸的PCR以确定所 述胎儿是否被所述病原体所感染。然而，羊膜穿刺具有1 %的流产风险，这是得其很难被怀 孕女性及其家庭成员所接受。由于IgM和IgG间接反映了机体的感染状态，并且其抗体只 是在一定时间段内产生于所述病原体，因此存在假阴性率。此外，由于不同的医院使用不同 的检测试剂盒，并且缺少统一的质量控制标准，来自不同医院的测试结果可能并不一致。测 试结果中的不一致降低了患者对于该检测的信任度和接受度，这使得医院不愿对怀孕妇女 使用基于ELISA的TORCH筛查方法。
[0009] 尽管最灵敏的直接检测病原体存在的方法时病原体培养，但其非常耗时并具有较 高的失败率。因此，还没有看到病原体培养的大规模临床应用。
【发明内容】
[0010] 本发明提供了用于胎儿健康状态的无创性检测方法，包含：在来自怀孕女性的生 物样本中，评估至少一个来自外源性生物体的多核苷酸、多肽和/或小分子。
[0011] 因此，在一方面，本发明提供了一种用于确定胎儿的健康状态的方法，所述方法包 含：a)在来自怀孕女性的生物样本中，评估至少一个来自外源性生物体的多核苷酸、多肽 和/或小分子的同一"性和/或水平；b)分析所述外源性多核苷酸、多肽和/或小分子的所 述同一性和/或水平；以及c)确定所述胎儿的所述健康状态，其中所述胎儿的所述健康状 态为无 HBV感染。在一些实施方案中，一些胎儿的的健康状况并非是外界生物的感染。在 一些实施方案中，所述小分子可以与宿主代谢相关。
[0012] 在一个实施方案中，所述胎儿是人类胎儿。在另一个实施方案中，所述分析是采用 至少1个正常对照进行的。在另一个实施方案中，所述生物样本为选自由以下所组成的组： 血清、血液、积液、尿液、骨髓、腹水、盆腔冲洗液、胸腔积液、脊髓液、淋巴液、粘液、痰、唾液、 眼房水、鼻腔提取物、咽喉拭子、生殖道拭子、来自消化组织的细胞悬浮液、和粪便提取物。 在另一个实施方案中，所述外源性生物体为选自由以下所组成的组：病毒、细菌、真菌和寄 生虫。在另一个实施方案中，所述健康状态为选自由以下所组成的组：基因异常、和发育异 常。在一些实施方案中，所述生物样本是从至少2、5、10、20、50、100、200、500或1000个怀 孕女性获得的。
[0013] 在一个实施方案中，所述基因异常为胎儿非整倍性。在另一个实施方案中，所述胎 儿非整倍性为选自由13三体性、18三体性和21三体性所组成的组的常染色体异常。在一 些实施例中，所述胎儿非整倍性为选自由X0、XXX、XXY和XYY所组成的组的性染色体异常。
[0014] 在第二方面，本发明提供了一种用于鉴定胎儿的健康状态的生物标志物的方法， 所述方法包含：a)在来自至少一个怀孕女性的生物样本中，评估来自外源性生物体的多核 苷酸、多肽和/或小分子的同一性和/或水平；b)对所述外源性多核苷酸、多肽和/或小分 子的所述的同一性和/或水平进行统计学分析；以及c)如果统计学显著相关性建立，则鉴 定所述非人类的多核苷酸、多肽或小分子作为针对所述健康状态的生物标志物，其中，所述 胎儿的所述健康状态为无 HBV感染，或所述生物样本是从至少100个怀孕女性获得的。在 一些实施方案中，所述胎儿的所述健康状态为无所述外源性生物体感染。在一些实施方案 中，所述小分子可以与宿主代谢相关。
[0015] 在一些实施方案中，所述胎儿是人类胎儿。在一些实施方案中，所述统计分析是采 用至少1个正常对照进行的。在另一个实施方案中，所述生物样本为选自由以下所组成的 组：血清、血液、积液、尿液、骨髓、腹水、盆腔冲洗液、胸腔积液、脊髓液、淋巴液、粘液、痰、唾 液、眼房水、鼻腔提取物、咽喉拭子、生殖道拭子、来自消化组织的细胞悬浮液、和粪便提取 物。在另一个实施方案中，所述外源性生物体为选自由以下所组成的组：病毒、细菌、真菌和 寄生虫。在另一个实施方案中，述健康状态为选自由以下所组成的组：基因异常、和发育异 常。
[0016] 在一个实施方案中，所述基因异常为胎儿非整倍性。在另一个实施方案中，所述胎 儿非整倍性为选自由13三体性、18三体性和21三体性所组成的组的常染色体异常。在一 些实施方案中，所述胎儿非整倍性为选自由XO、XXX、XXY和XYY所组成的组的性染色体异 常。
[0017] 在一些实施方案中，所述生物标志物为选自由以下所组成的组：小地老虎核型 多角体病毒（Agrotis ipsilon multiple nucleopolyhedrovirus)、假单胞杆菌菌体 FlO (Pseudomonas phage F10)、鼻疽菌体 Bcep22 (Burkholderia phage Bcep22)、脑心 肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus)、丙型肝炎病毒基因型 l(Hepatitis C virus genotype I)、肠杆菌菌体 M13 (Enterobacteria phage M13)、人类 1 型疱疼病毒（Human herpesvirus 1)、人类 7 型疱疼病毒（Human herpesvirus 7)、鲤疱疼病毒 3(Cyprinid herpesvirus)、葡萄球菌菌体37(Staphylococcus phage 37)、西纵色卷蛾颗粒体病 毒(Choristoneura occidentalis granulovirus)、棉铃虫裸病毒 2 (Helicoverpa zea nudivirus2)、和肠杆菌菌体Sf6〇
[0018] 在一些实施方案中，所述生物样本是从至少2、5、10、20、50、100、200、500或1000 个怀孕女性获得的。
[0019] 在第三方面，本发明提供了一种用于确定胎儿的健康状态的方法，所述方法包含： a)评估利用本发明所公开的方法在来自怀孕女性的生物样本中所鉴定出的至少一个生物 标志物的同一性和/或水平；b)分析所述生物标志物的所述同一性和/或水平；以及c)确 定所述胎儿的所述健康状态。
[0020] 在一些实施方案中，所述胎儿是人类胎儿。在一些实施方案中，所述生物样本为选 自由以下所组成的组：血清、血液、积液、尿液、骨髓、腹水、盆腔冲洗液、胸腔积液、脊髓液、 淋巴液、粘液、痰、唾液、眼房水、鼻腔提取物、咽喉拭子、生殖道拭子、来自消化组织的细胞 悬浮液、和粪便提取物。在一些实施方案中，所述生物标志物为多核苷酸。在一些实施方案 中，步骤a)包含对来自所述生物样本的无细胞DNA进行纯化。在一些实施方案中，对所述 DNA进行扩增。在一些实施方案中，对所述DNA建立文库。在一些实施方案中，对所述DNA 进行测序。在一些实施方案中，采用高通量测序对所述DNA进行测序。在一些实施方案中， 步骤b)包含：将从步骤a)获得的所述序列与所述生物标志物的序列进行比较。在一些实 施方案中，在步骤b)之前，从步骤a)获得的所述序列中去除与人类基因组序列相匹配的序 列。
[0021] 在第四方面，本发明提供了一组用于确定人类胎儿的21三体性的生物标志物， 其包含多个选自由以下所组成的组的生物体：切根虫核型多角体病毒、假单胞杆菌噬菌体 F10、鼻疽噬菌体Bcep22、