利那洛肽的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及利那洛肽的制备方法。
【背景技术】
[0002] 利那洛肽是在成年中治疗便秘肠易激综合征（IBS-C)和慢性特发性便秘（CIC)的 药物（鸟苷酸环化酶一 C(GC-C)的激动剂）。利那洛肽与肠道GC-C结合后，导致细胞内外 环鸟苷酸（cGMP)浓度升高。细胞内cGMP升高可以刺激肠液分泌，加快胃肠道移行，从而增 加排便频率。细胞外cGMP浓度升高可以降低痛觉神经的灵敏度，可减低肠道疼痛。此外，利 那洛肽也可用于治疗和预防结肠癌、直肠癌和机体炎症。利那洛肽序列为SEQ ID N0 :1所示 的序列：CysCysGluTyrCysCysAsnProAlaCysThrGlyCysTy;r。在 1 位和 6 位、2 位和 10 位以及 5位和13位的半胱氨酸残基之间通过氧化形成二硫键成环，到目前为止，利那洛肽及其相 关肽的合成制备仅得到10-25%的产物，例如文献Optimized Fmoc Solid-Phase Synthesis of the Cysteine-Rich Pertide Linaclotide, Published online4August2010in Wiley Online Library,报道的制备方法。中国专利公开号CN102875655A，其氧化步骤进一步简 化，产率也有所提高，但是其收率仍然不理想，环化过程复杂且环化产率低，需要消耗大量 的溶剂和原料，且需要大量的时间分离提纯，给工业化生产带来不便。
【发明内容】
[0003] 为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种利那洛肽的制备方法，简化环化 过程，提升环化广率，使广品收率提商。
[0004] 本发明的技术方案是：具有如下结构的利那洛肽的制备方法，
【主权项】
1. 具有如下结构的利那洛肽的制备方法，
其特征在于：包括如下步骤： (1) 采用固相Fmoc技术，将羧基树脂和侧连带有保护基的Fmoc酪氨酸置于反应瓶中， 加入有机碱和偶合剂，在DMF溶液中反应后，脱除Fmoc保护基团，得到与侧连带有保护基的 酪氨酸偶联的树脂； (2) 将步骤（1)得到的与侧连带有保护基的酪氨酸偶联的树脂直接和侧连带有保护基 的Fmoc半胱氨酸置于反应瓶中,加入有机碱及偶合剂,在DMF溶液中反应后，脱除Fmoc保 护基团，得到进一步与侧连带有保护基的半胱氨酸偶联的树脂； (3) 依次重复步骤（2)，其中原料氨基酸依次替换为Fmoc甘氨酸、侧连带有保护基的 Fmoc苏氨酸、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸、Fmoc丙氨酸、Fmoc脯氨酸、侧连带有保护 基的Fmoc天冬酰胺、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸、 侧连带有保护基的Fmoc苏氨酸、侧连带有保护基的Fmoc谷氨酸、侧连带有保护基的Fmoc 半胱氨酸、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸，最终得到脱除Fmoc保护基团、且与上述氨基 酸依次偶联的树脂； (4) 切割步骤（3)所得与上述氨基酸依次偶联的树脂，得到化合物： H〇-Tyr-Cys-Gly-Thr-Cys-Ala-Pr〇-Asn-Cys-Cys - Tyr-Glu-Cys-Cys-H ； (5) 将步骤（4)所得化合物用单质碘在pH=6-13的磷酸钠缓冲溶液中氧化，形成三个 二硫键得到利那洛肽产品：
2. 根据权利要求1所述的利那洛肽的制备方法，其特征在于，所述侧连带有保护基的 Fmoc酪氨酸、侧连带有保护基的Fmoc半胱氨酸、侧连带有保护基的Fmoc苏氨酸、侧连带有 保护基的Fmoc天冬酰胺、侧连带有保护基的Fmoc谷氨酸依次为叔丁基保护的Fmoc酪氨 酸、三苯甲基保护的Fmoc半胱氨酸、Trt保护的Fmoc苏氨酸、Trt保护的Fmoc天冬酰胺、 tBu保护的Fmoc谷氨酸。
3. 根据权利要求1所述的利那洛肽的制备方法，其特征在于，所述羧基树脂为王树脂； 所述有机碱为二异丙基乙基氨；所述偶合剂为苯并三氮唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸 盐。
4. 根据权利要求1所述的利那洛肽的制备方法，其特征在于，所述各种侧连带有保护 基的Fmoc氨基酸与羧基树脂的摩尔比均为2~8/1。
5. 根据权利要求1所述的利那洛肽的制备方法，其特征在于，所述偶合剂与羧基树脂 摩尔比2~8/1。
6. 根据权利要求1所述的利那洛肽的制备方法，其特征在于，所述碱与各种侧连带有 保护基的Fmoc氨基酸摩尔比均为2~6/1。
7. 根据权利要求1所述的利那洛肽的制备方法，其特征在于，所述脱除Fmoc保护基团 的体系是六氢哌啶/DMF混合液；所述六氢哌啶/DMF混合液的体积比1/4,所述六氢哌啶/ DMF混合液加入量为10-30mL/g树脂。
8. 根据权利要求1所述的利那洛肽的制备方法，其特征在于，所述步骤（5)中磷酸钠缓 冲溶液中单质碘的含量2-15%。
9. 根据权利要求1所述的利那洛肽的制备方法，其特征在于，所述步骤（5)中氧化的时 间为6-12h，氧化的温度为15-30°C。
10. 根据权利要求1所述的利那洛肽的制备方法，其特征在于，所述氧化二硫键反应位 置发生在按N端到C端的顺序：1位和6位、5位和13位、2位和10位半胱氨酸双硫键。
【专利摘要】本发明提供利那洛肽的制备方法，利用标准的Fmoc技术，将侧链保护的氨基酸与WANG树脂相连，加入缩合剂HBTU和碱DIPEA，在DMF溶剂中发生缩合反应，采用含20%六氢哌啶的DMF溶液进行脱Fmoc保护,然后从固相树脂上切下来。在磷酸钠缓冲溶液中加入碘单质进行氧化Cysteine，获得利那洛肽。本发明提供的利那洛肽的制备方法是高产率的合成利那洛肽的工艺，简化了环化过程，提升了环化产率，最终产品收率达到30%-60%；该制备方法简便、反应条件温和、收率较高、得到产品纯度高，是利那洛肽产业化可行的制备方法，为工业生产提供了良好的前景。
【IPC分类】C07K1-04, C07K7-08, C07K1-06
【公开号】CN104628826
【申请号】CN201310556661
【发明人】吴君臣, 刘奔, 邹荣峰, 王 琦, 田禾
【申请人】华东理工大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2013年11月11日