一种抗BLyS单链抗体及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体涉及抗B淋巴细胞刺激因子(BLyS)的单链抗体及其制备方法和医药用途。
【背景技术】
[0002]B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator，BLyS，也被称为BAFF)最早于1999年由Moore等多个研宄小组独立发现的一种全新的、具有重要免疫调节功能的细胞因子。BLyS属于肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor，TNF)超家族成员，是一个典型的II型跨膜单链糖蛋白。
[0003]BLyS由285个氨基酸组成，分子量大小约为31.3kDa，其胞外区134-285位氨基酸可在弗林蛋白酶的作用下发生水解，形成可溶性的功能片段。虽然BLyS能以膜结合的形式存在，但BLyS主要以可溶的同源三聚体形式与其受体结合发挥相应的生物学功能。目前发现的BLyS受体主要有三个:TACI，BCMA和BAFF-R。其中BLyS与BAFF-R为特异性结合，两者的相互作用是B细胞赖以生存的必要条件。
[0004]BLyS可大量发现于外周血及淋巴组织细胞的培养上清中，其主要表达于诸如中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞等先天固有的免疫细胞中；在IFNy、IL-10以及 G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)等细胞因子的刺激下会增强BLyS的表达。BlyS具有明显的B细胞趋向性并能特异性的结合B细胞，其对于B细胞的增殖、分化、成熟以及生存等方面发挥着非常重要的调控作用，而BLyS对由B细胞介导的自身免疫性疾病的过程以及T淋巴细胞瘤起着重要的影响。BLyS过表达与多种自身免疫性疾病有着密切的联系，如系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus, SLE)、肖格伦综合征(Sjogren’sSyndrome，SS)、类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)、重症肌无力(MyastheniaGravis，MG)等等(参见，例如，The complexity of the BAFF TNF-familymembers:1mplicat1nsfor autoimmunity.Lahiri A 等 J Autoimmun.2012Sep ；39(3):189-98.do1:0.1016/j.jaut.2012.05.009.Epub 2012Jun 29)。以 BLyS 为作用靶点的药物，尤其以贝利木单抗为代表的单克隆抗体药物等，在治疗SLE等自身性免疫疾病方面取得非常好的临床效果。
[0005]单链抗体(single chain variable fragment, ScFv)是通过基因工程将抗体的重链可变区(variable reg1n of heavy chain, VH)与轻链可变区(variable reg1n oflight chain,VL)通过一段连接肽而形成的一种重组蛋白。单链抗体既保持了亲本抗体与抗原的结合特异性和相当的亲和力，因为分子量小更容易进入肿瘤组织和细胞，发挥相应的作用；并且单链抗体不具有完整抗体的Fe段，因而其不会与补体受体结合，避免了全长I gGI的抗体依赖的细胞毒和补体依赖的细胞毒性。
[0006]虽然目前噬菌体抗体库为相对最成熟且应用最多的抗体库技术，但是噬菌体抗体库属于原核表达体系，与真核表达体系存在差异，而表达系统差异越大，抗体改构后的活性发生改变的可能性就越大。哺乳动物细胞抗体库属于真核表达体系，它具有原核表达体系所不具备翻译后修饰功能，而这也是决定蛋白生物活性的关键之一。由于本实验室构建的哺乳动物细胞抗体库是应用人源293T细胞建库，因此获得的抗体最近接天然人源抗体，在保证亲和力的同时，也使所获的候选抗体的免疫原性大大降低。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供能抗B淋巴细胞刺激因子抗体。
[0008]本发明提供了一种抗人B淋巴细胞刺激因子单链抗体，其具有选自下列可变区:
(a)重链可变区包括SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列；(b)轻链可变区包括SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列；(c)重链可变区包括SEQ ID N0:4所示氨基酸序列，且轻链可变区包括SEQ IDNO:6所示氨基酸序列；(d)重链可变区与SEQ ID N0:4所示氨基酸序列具有至少90%同一性；或(e)轻链可变区与SEQ ID NO:6所示氨基酸序列具有至少90%同一性。
[0009]因此，目标抗体可能包含a) —个重链可变区，其氨基酸序列与序列4所示序列至少有约 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%gg 100%的一致性和 b) 一个轻链可变区，其氨基酸序列与序列6所示序列至少有约91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的一致性。
[0010]在一个优选实施方案中，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:3，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID N0:4。
[0011 ] 在一个优选实施方案中，编码所述重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列为SEQID NO: 1，编码所述轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
[0012]另一方面，本发明提供了具有选自下列可变区的单链抗体:
[0013](a)重链可变区的编码基因包括SEQ ID NO:3所示核苷酸序列；(b)轻链可变区的编码基因包括SEQ ID NO:5所示核苷酸序列；(c)重链可变区的编码基因包括SEQ ID NO:3所示核苷酸序列，且轻链可变区的编码基因包括SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列；(d)重链可变区的编码基因能与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列在严谨条件下杂交；或(e)轻链可变区的编码基因能与SEQ ID NO:5所示核苷酸序列在严谨条件下杂交。
[0014]一个优选实施方案中，所述单链抗体的重链可变区的编码核苷酸序列为SEQ IDNO: 3，轻链可变区的编码核苷酸序列为SEQ ID NO: 5。
[0015]在一个具体实施方案中，本发明所述单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
[0016]在一个具体实施方案中，本发明所述单链抗体的编码基因的核苷酸序列为SEQ IDN0:2o
[0017]另一方面，本发明提供了重组表达载体，其中含有编码本发明所述单链抗体全长或可变区的核酸序列。
[0018]另一方面，本发明提供了宿主细胞，所述宿主细胞被本发明所述的重组表达载体所转化。
[0019]本发明实验证明，本发明提供的单链抗体与BLyS具有高亲和力，BLyS过表达与多种自身免疫性疾病有着密切的联系，如系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)、肖格伦综合征(Sjogren' sSyndrome, SS)、类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)、重症肌无力(Myasthenia Gravis, MG)等。以BLyS为作用勒点的药物在治疗SLE等自身性免疫疾病方面取得非常好的临床效果。
[0020]因此，另一方面，本发明提供了一种用于治疗自身免疫病的药物组合物，其包含有效量的作为活性成分的本发明所述的单链抗体和药用载体。
[0021]术语“有效量”指可有效治疗哺乳动物中的疾病或病症的药物量。
[0022]术语“药效上可接受的载体”指一种或多种有机或无机成分，它可以使天然的或合成的，与抗体组合后可促进其应用。可接受的载体包括无菌的生理盐水或是其他药学上可获得的且为本领域所熟知的水或非水的等渗溶液或灭菌混悬剂。
[0023]另一方面，本发明提供了一种针对自身免疫病的诊断试剂，其包含本发明所述的单链抗体、能够产生可检测信号的标记物及使用说明书。
[0024]另一方面，本发明提供了本发明所述单链抗体在制备用于治疗自身免疫病的药物中的用途。
[0025]另一方面，本发明提供了本发明所述单链抗体在制备自身免疫病的诊断试剂中的用途。
[0026]本发明中所述的自身免疫病包括但不限于系统性红斑狼疮、肖格伦综合征、类风湿关节炎或重症肌无力等。
[0027]本发明所述单链抗体的重链可变区中的⑶R1、⑶R2、⑶R3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 所示；轻链可变区中 CDRl、CDR2、CDR3 的氨基酸序列分别如 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12 所示。因此，
[0028]另一方面，本发明提供了一种抗人B淋巴细胞刺激因子单克隆抗体，其重链可变区中 CDR1、CDR2、CDR3 的氨基酸序列为 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9;和 / 或其轻链可变区中CDRU CDR2、CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ IDNO:12ο
[0029]可变区⑶R的变体与上述⑶R区可以有至多6个氨基酸残基(例如，1、2、3、4或5个氨基酸取代)的取代，在具有CDR变体的单克隆抗体中，CDR区变体具有与B淋巴细胞刺激因子结合活性。
[0030]本发明所述单克隆抗体除了重链和轻链中的高度可变区⑶R1、⑶R2和⑶R3和链接序列外，其它为框架区。框架区可在结合所需的三维结构不受影响的条件下倍其他序列置换，抗体特异性的分子基础主要来源于它的高变区⑶R1、⑶R2和⑶R3。这些区域是与抗原结合的关键部位。为维持优选的结合特性，CDR的序列应尽可能保留，然而，可能需要一些氨基酸改变使结合特性最优化，本领域的技术人员可以用标准做法来达到此目的。
[0031]所述的单克隆抗体为单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、抗体片段或含有所述抗原结合结构域的任何多肽。
[0032]本发明所述“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE, IgM, IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb或Fd,或者双链抗体。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。
[0033]抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗原特异性的其他抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区