一种高山被孢霉ccfm442菌株及其用图
【专利说明】-种高山被抱霉CCFM442菌株及其用途 【技术领域】
[0001] 本发明属于动物饲料技术领域。更具体地，本发明设及一种高山被抱霉CCFM442 菌株，还设及所述高山被抱霉CCFM442菌株的用途。 【【背景技术】】
[0002] 多不饱和脂肪酸（PUFAs)可分为0-6和0-3等系列。0-6系列PUFAs主要有亚 油酸（LA)、丫-亚麻酸（GLA)、花生四締酸（AA)等。AA是人体前列腺素合成的重要前体物 质，它具有增加血管弹性和提高免疫力等生理功能，是重要的奶粉营养补充剂。《-3系列 PUFAs主要有a-亚麻酸（ALA)、二十碳五締酸巧PA)、二十二碳五締酸值PA) W及二十二碳 六締酸值HA)。EPA能降低血液胆固醇水平W及动脉粥样硬化发生风险。DHA在提高婴幼儿 智力等方面具有重要作用。W册和FA0提出膳食中0-6PUFAS和0-3PUFAS的比例下 简称0-6/W-3比）的最适值为巧-10) ;1，在我国该比例严重失衡，达（10-30) ;1。流行病 学资料显示，饮食中《-6/0-3比过高与某些疾病的高发密切相关，如糖尿病、冠屯、病、乳 腺癌等。因此，提高饮食中W-3PUFAS比例并维持0-6/0-3比在适宜范围内具有重要意 义。
[0003] ?-3系列PUFAs多来自于动物肝脏和鱼油等材料，因环境污染等因素，其生产受 到限制。高山被抱霉（Modierella alpina, M. alpina)是目前产PUFAs真菌中唯一经过正 式安全性评估的菌种，其发酵生产W-3PUFAS已被实验证实可行。利用Ealpina菌体制作 菌饲料饲喂蛋鸡，可使鸡蛋中的《-3PUFAs含量增加，该有助于提高饮食中0-3PUFAS的比 例。 【
【发明内容】
】
[0004] [要解决的技术问题]
[0005] 本发明的目的是提供一种高山被抱霉CCFM442菌株。
[0006] 本发明的另一个目的是提供所述高山被抱霉CCFM442菌株的用途。
[0007] [技术方案]
[000引本发明是通过下述技术方案实现的。
[0009] 本发明设及一种高山被抱霉Mo;rtierella alpina CCFM442,该菌株已于2014年 12月25日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中屯、保藏，其保藏号为CGMCC No 10295。
[0010] 高山被抱霉菌株CCFM442为对高山被抱霉野生型菌株进行遗传修饰后获得 的工程菌株。具体遗传修饰方法W及所得菌株的生物学性质参见中国专利申请CN 201410087487. 1的记载。所得的高山被抱霉具体培养条件如下；它先在温度28°C与转速 为2(K)r/min的条件下培养2天，然后在温度12°C与转速2(K)r/min的条件下培养8天，高 山被抱霉菌株CCFM442积累脂肪的规律较野生型菌株发生明显变化，其中EPA占总脂肪酸 的比例明显增加，约为野生型菌株的7倍。正是由于该种性质的改变，为高山被抱霉菌株 CCFM442成为相对高产0-3PUFAS的工业菌株奠定了基础。
[0011] 本发明还设及所述的高山被抱霉CCFM442菌株在生产菌体饲料添加剂中的用途。
[0012] 根据本发明的一种优选实施方式，生产本发明菌体饲料添加剂的步骤如下：
[001引 A、斜面培养
[0014] 将冷冻保存的高山被抱霉CCFM442菌株挑取一环接种到PDA斜面培养基上，然后 在温度25°C的条件下恒温培养14天，得到所述菌株活化培养物。
[0015] 本发明使用的PDA斜面培养基是根据其常规配方配制的。PDA斜面培养基成分如 下；200g马铃馨、20g葡萄糖、15g琼脂与1L自来水，使用氨氧化钢及氯化氨水溶液将其抑 调节为6. 0-6. 2。
[0016] 在该个步骤中，斜面培养所使用的设备是上海森信实验仪器有限公司销售的隔水 式恒温培养箱（型号；GRP-9080)。
[0017] B、种子培养
[0018] 将步骤A得到的活化培养物挑取一环接种到种子培养基中，在温度25°C与20化pm 的条件下恒温振荡培养3天，再称得湿菌体重，将湿菌体与无菌水按照湿菌体与无菌水质 量比1 ;4进行混合，接着用分散机对该混合体系进行分散lOmin W制备菌悬液，再按照每升 所述菌悬液为lOmL的接种量接种于所述种子培养基中，在温度25°C与转速20化pm的条件 下恒温振荡培养36h，得到高山被抱霉CCFM442种子液。
[0019] 本发明使用的种子培养基是根据下述配方配制的；20g/L葡萄糖、lOg/L硝酸钟、 3g/L磯酸二氨钟、5g/L酵母提取物与0. 25g/L硫酸儀，自然抑。
[0020] 在该个种子培养步骤中，使用的培养设备是上海知楚仪器有限公司销售的振荡培 养箱（型号；ZQZY-70B)。
[0021] 本发明使用的分散机是艾卡仪器设备有限公司销售的分散机（型号；T10B)。
[0022] C、发酵培养
[0023] 按照W发酵培养基体积计1% -5%接种量，将步骤B得到的高山被抱霉CCFM442 种子液接种到发酵培养基中，首先在温度25°C的条件下培养2天，接着在温度6°C的条件下 培养5天，得到含有高山被抱霉CCFM442的发酵液。
[0024] 根据本发明，发酵采用变温培养的主要目的在于温度25°C为高山被抱霉CCFM442 最适宜生长温度，在该温度下培养2天可使菌体生物量增至最大；温度6°C为高山被抱霉 CCFM442发酵生产EPA的适宜温度，在此温度下培养5天可使菌体积累大量EPA。
[0025] 在该个步骤中，根据发酵液溶氧量判断菌体生物量是否增至最大，由于培养初期 菌体快速生长需消耗大量氧气，所W发酵液溶氧量逐步下降，下降至最低点后溶氧有缓慢 升高，该时间点（在温度25°C下培养2天）时菌体生物量最大。
[0026] 在该个发酵培养步骤中，使用的培养设备是New Brunswick公司销售的化发酵罐 (型号；BioFlo 115)。
[0027] 所述发酵培养基制备方法如下：制备含有50g/L葡萄糖碳源、20g/L豆稍、13. 34g/ L硝酸钟、3g/L磯酸氨二钟、Ig/L硫酸钢、0. 5g/L二水合氯化巧与0. 5g/L六水合氯化儀的 混合物水溶液，将其水溶液的pH调节至6. 0,再在温度121°C下灭菌20min，得到所述的发酵 培养基。
[002引所述水溶液的抑是使用硫酸及氨氧化钟水溶液调节的。
[0029] D、后处理
[0030] 让步骤C得到的含有高山被抱霉CCFM442的发酵液进行离屯、分离，得到的湿菌体 用蒸馈水进行洗漆，再离屯、分离，洗漆湿菌体接着干燥，于是得到一种干燥菌体，即所述的 菌体饲料添加剂。
[0031] 在该个步骤中，所述的洗漆是使用W湿菌体体积计3-5倍蒸馈水洗漆2-4次。
[0032] 在该个步骤中，第一次与第二次离屯、分离都是在转速eOOOrpm的条件下进行离屯、 分离lOmin。离屯、分离所使用的设备是化ermo销售的离屯、机（型号；LYNX 4000)。
[0033] 在该个步骤中，所述的干燥是在温度48-52°C与风速2. l-2.5m/s的条件下干燥 85-95min。
[0034] 本发明使用的干燥设备是上海森信实验仪器有限公司销售的电热恒温鼓风干燥 箱（型号；DGG-gi 23A)。
[0035] 采用本发明方法得到的干燥菌体，即所述的菌体饲料添加剂的含水率为W干燥菌 体总重量计25. 4-26. 4%，总脂肪酸含量为7. 6-10. 7%，其中多不饱和脂肪酸在总脂肪酸 中的含量是42. 4-45. 8%。
[0036] 所述的含水率测定参考GB/T 5009. 3-2003。
[0037] 所述的粗脂肪测定参考GB/T 14772-2008。
[00測所述的脂肪酸测定参考文献Wang L Chen W,化叫Y, et al. Genome characterization of the oleaginous fungus Mortierella alpina.Plos 0ne6:e28319.。
[0039] 在总脂肪酸测定之后，对相应脂肪酸含量进行加和后可得所述的多不饱和脂肪酸 含量。
[0040] 由所述多不饱和脂肪酸中的《-6系列与0-3系列多不饱和脂肪酸含量可m十算 出，0-6/0-3 比为 4. 5-5. 3。
[0041] 根据本发明，所述菌体饲料添加剂的用量是基础饲料总重量的5-10%。
[0042] 本发明菌体饲料添加剂的脂肪酸组成合理，能提供有利于食用者身体健康的鸡 蛋。该添加剂具有使用安全性高、PUFAs含量高、脂肪酸组成合理等优点，在不降低产蛋性 能参数的情况下提高鸡蛋中AA、DHA的含量，并维持《-6/?-3比在合理范围内。
[00创[有益效果]
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