海洋微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体设及一种低温葡 萄糖氧化酶海洋微生物发酵生产方法。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, E. C 1. 1. 3. 4,简写为GOD)在有氧条件下专一 性催化0-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氨（Ahmed H等，Eur Biophys J，1998)。GOD主 要分布于动物、植物和微生物体内，其中动、植物组织中GOD含量有限，而微生物由于其自 身具有来源广泛、生长周期短等优点，是生产god的主要来源，目前，GOD的主要生产菌株为 黑曲霉和青霉（王志新等，中国食品学报，2007)。早期GOD的生产主要从动、植物体内提取， 但该方法很难得到纯度高的G0D，而微生物发酵法具有发酵生产工艺简单，提取步骤相对 简易，酶的纯化工艺稳定，生产不受原料来源影响等特点，且生产的GOD在安全性方面具有 更大优势，适用于批量生产，容易实现产业化，还可W与食品生产、饲料生产和医药检测材 料联合在一起，具有广阔市场应用前景（邢良英等，食品科技，2007 ;张岳励等，饲料工业， 2011)。国外对GOD的研究比较早，主要在菌种筛选、产酶条件的优化、酶的分离纯化、酶学 特性W及GOD基因的克隆与表达等方面都有深入研究（Sisak C等，Enzyme and Microbial Technology, 2006 ;Mislovicova D 等，Process Biochemistry, 2007;)。相比国外，我国有 关GOD的研究工作起步较晚（朱运平等，中国食品添加剂，2013)目前我国虽有GOD产品出 售，但酶制剂纯度及活性普遍较低，稳定性差，生产成本较高，主要依赖进口（韩建春等，食 品科学，2011)。
[0003] 低温酶在低温下具有高酶活力及高催化效率，可大大缩短处理过程的时间并省却 昂贵的加热或冷却费用；在节能方面有相当大的优势；经过温和的热处理即可使低温酶的 活力丧失，而低温或适温处理不会影响产品的品质（陆小波等，生物技术通报，2006 ;曾胤 新等，中国生物工程杂志，2003)低温GOD利用低温酶上述优点使其具有非常广阔的开发潜 力和应用前景。低温GOD将为人类摆脱生存和发展中所面临的诸如疾病、资源、能源危机W 及环境污染等困境提供现实的机遇，具有非常广阔的开发潜力和应用前景。目前国内外未 见低温GOD的相关报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种海洋微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法，该方法 主要是微生物经过低温驯化后，在10~16°c液体发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法，该种 生产方法获得的低温葡萄糖氧化酶粗酶液活性可W达到227. lU/ml，如再经过分离和纯化， 可W得到不同浓度和纯度的酶制剂。本发明所述的一种微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶 的方法具体包括W下步骤：
[0005] (1)将能产生葡萄糖氧化酶的菌种先活化，再经过逐级低温驯化，驯化温度由高到 低，25°C - 22°C - 20°C - 18°C - 16°C - 14°C 一 12°C - 10°C，使其在低温环境中生长良 好，当菌种能在低温下稳定生长即驯化结束；该菌种的低温驯化培养基为；葡萄糖20. 0~ 50.0 g，蛋白腺 1. 0 ~5. Og，（畑4)25〇4 2. 0 ~3. Og，CaC〇3 1. 0 ~5. Og，pH 值为自然，于 103kpa、121°C高压蒸气灭菌30min ;
[0006] 所述的能产生葡萄糖氧化酶的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中屯、（CGMCC)，菌种编号；1. 10601或1. 6446或1. 10904 ;
[0007] 似按常规方法将步骤（1)中低温驯化后的葡萄糖氧化酶产生菌在液体种子培养 基中于10~16°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；所述的液体种子培养基 为；蛋白腺7.0~12.0g，牛肉膏2.0~7.0g，化C1 8.0~ll.Og，抑值为自然，于103kpa、 121°C高压蒸气灭菌30min ;
[000引 （3)将液体二级种子按发酵液体积3~9%的接种量接入液体产酶培养基中，在 10~16°C培养72~14化时，即微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶结束；所述的液体产酶 培养基为：葡萄糖75. 0~85. Og,蛋白腺1. 0~5. Og，KH2P04 1. 4~2. 0g，M拆04.7&0 0. 7~ 0. 8g，KCl 0. 2 ~0. 6g,抑值为 5. 6,于 103kpa、12rC高压蒸气灭菌 30min;
[0009] (4)将做的发酵液在4, 000~8, 00化pm离屯、收集液体，收集到的上清液即为粗 酶液；
[0010] (5)根据不同需要和使用对象不同，还可W将（4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离 纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温葡萄糖氧化酶制剂。
[0011] 进一步的，步骤（1)中产生葡萄糖氧化酶的菌种活化培养基为；蛋白腺10.0 g，酵 母膏5. Og,化C1 10.0 g,琼脂20.0 g，蒸馈水1.0L，抑值为自然，于103kpa、121°C高压蒸气 灭菌30min。
[0012] 本发明中使用的能产生葡萄糖氧化酶的菌种初期活化和生长条件按中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、提供的说明进行。葡萄糖氧化酶产生菌菌株先活化、 再经过逐级低温驯化后发酵生产低温葡萄糖氧化酶时按本发明产酶条件进行培养，低温驯 化后的菌株在4°C环境中可保存2个月，用10~25^%甘油制成的菌悬液、在-80°C条件下 可W长期保藏。
[0013] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0014] (1)本发明利用海洋微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶，经过温和的热处理即可 使低温酶的活力丧失，而低温或适温处理均不会影响产品的品质，特别是低温脂肪氧合酶 在低温下仍具有高酶活力及高催化效率，有效改善并提高产品质量；
[0015] (2)本发明方法简化了生产工艺，缩短加工时间并从根本上省却中温酶使用中加 热、冷却设备的环节，省却昂贵的加热或冷却费用，在节能方面有相当大的优势；
[0016] (3)本发明方法生产的葡萄糖氧化酶应用操作简单、方便、快捷、成本低，无论在食 品工业、饲料行业、医药工业、纺织漂染等行业还是生物燃料、生物传感器及生物巧片等新 兴领域都有广泛应用。
【具体实施方式】
[0017] 下面通过【具体实施方式】对本发明做进一步说明，但并不限制本发明。如无特殊说 明，本发明所用原料均市售可得。
[001引实施例1
[0019] (1)培养基制备
[0020] ①菌种活化培养基；蛋白腺10.0 g，酵母膏5. Og，化Cl 10.0 g，琼脂20.0 g，蒸馈水 1. 抑值为自然，于103kpa、121°C高压蒸气灭菌30min ;
[0021] ②菌种低温驯化培养基；葡萄糖20.0 g，蛋白腺1. Og，（畑4) 2SO4 2. Og，CaC〇3 1. Og,抑值为自然，于103kpa、121°C高压蒸气灭菌30min ;
[002引⑨液体种子培养基；蛋白腺7. Og，牛肉膏2. Og，化C1 8. Og，pH值为自然，于 103kpa、121°C高压蒸气灭菌30min ;
[002引④液体产酶培养基：葡萄糖75. Og，蛋白腺1. Og，K&POJ. 4g，MgS04 ? 7&0 0. 7g，KCl 0. 2g，抑值为 5. 6,于 103kpa、12rC高压蒸气灭菌 30min;
[0024] (2)将产生葡萄糖氧化酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中屯、（CGMCC) 提供的菌株说明进行初始活化；
[0025] (3)将（2)中活化好的菌种于低温驯化培养基中逐级低温驯化，驯化温度由高到 低，25°C - 22°C - 20°C - 18°C - 16°C - 14°C一 12°C - 10°C，驯化 8 天左右，使其在低温环 境中生长良好，当菌种能在低温下稳定生长即驯化结束；
[0026] (4)按常规方法将低温驯化后的葡萄糖氧化酶产生菌在液体种子培养基中于 10~12°C培养48~7化后，按5vt%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和 二级种子；
[0027] 妨将（4)制备的二级种子按发酵液体积3~5%的接种量接入10L的液体产酶 培养基中，在10~12°C培养120~14化时，即海洋微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶结 束；
[002引 做将妨的发酵液在4, 000~8, 00化pm离屯、收集液体，收集到的