转录组文库的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及文库构建领域，具体而言，设及一种转录组文库的构建方法。
【背景技术】
[0002] 利用第二代高通量测序技术对待测生物样品的转录本（mRNA和非编码RNA)进行 测序，能够全面快速地获取特定待测生物样品在特定状态下的所有转录本的信息。通过转 录组测序研究可W揭示待测生物样品不同表现型形成的分子调控机制。
[0003] 转录组建库时通常先去除总RNA中的rRNA(可W利用Ribo-zero试剂盒进行 去除），然后利用现有技术中的RNA文库构建试剂盒进行转录组文库的构建（比如采用 肥B Next? Ultra Directional RNA Library Pr巧Kit进行建库），具体操作按试剂盒操作 说明书进行。
[0004] 然而，目前转录组文库构建方法往往会出现测序数据比对率（mapping率）低的问 题。是通过测序完成后对文库测序数据进行核巧酸数据库（NT)比对来评估测序数据中的 污染情况，即取10000条reads数据比对到NCBI核巧酸数据库（NT)，选取比对结果中的前 5个同源比对，判定样本是否存在外源污染。该种文库构建方法和污染评估方法并不能改变 其所构建的转录组文库测序数据比对率的状况，因此，仍需要对现有的转录组文库构建方 法进行改进，W提高所构建的转录组文库后续得到的测序数据的比对率。
【发明内容】
[0005] 本发明的主要目的在于提供一种转录组文库的构建方法，W解决现有技术所构建 的转录组文库后续得到的测序数据的比对率低的问题。
[0006] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种转录组文库的构建方法， 该方法包括W下步骤；S1，对待测菌种中总RNA是否存在污染进行鉴定；S2,从未受污染的 待测菌种的总RNA中去除rRNA，得到mRNA和非编码RNA ;S3,对mRNA和非编码RNA进行转 录组文库的构建，得到转录组文库。
[0007] 进一步地，步骤S1中利用rRNA对待测菌种的总RNA是否存在污染进行鉴定。
[000引 进一步地，总 RNA 中的 rRNA 为 16S rRNA、18S rRNA 或 ITS rRNA。
[0009] 进一步地，步骤SI包括w下步骤；sil，对待测菌种的总RNA进行反转录，得到 cDNA ;S12, W cDNA为模板，对待测菌种的rRNA进行扩增并测序，得到测序序列；S13,将测 序序列与NCBI核巧酸数据库中的参考序列进行同源性比对，得到比对结果；S14,根据比对 结果判断总RNA是否存在污染。
[0010] 进一步地，rRNA 为 16S rRNA、18S rRNA 或 ITS rRNA 的全长序列。
[0011] 进一步地，步骤S13中，比对结果为；（1)测序序列与至少前10条同源性高的参考 序列来源于同一菌种，且菌种为目的菌种；或者（2)测序序列与至少前10条同源性高的参 考序列来源于两种或两种W上的菌种。
[0012] 进一步地，当比对结果为（1)时，步骤S14包括；根据比对结果，查看测序序列的测 序峰图是否存在套峰现象，若不存在，则判断总RNA不存在污染；当比对结果为（2)时，步 骤S14包括；根据比对结果，查看测序序列的测序峰图是否存在套峰现象，若存在，则判断 总RNA存在污染。
[0013] 进一步地，步骤S2采用Ribo-zero试剂盒从总RNA中去除rRNA。
[0014] 进一步地，步骤S3包括W下步骤；S31，对mRNA和非编码RNA进行进行反转录， 得到双链cDNA ;S32,对双链cDNA依次进行末端修复、加A和连接头，得到带接头修复双链 cDNA ;S33,对带接头修复双链cDNA进行US邸酶消化及PCR富集，得到转录组文库。
[0015] 进一步地，在步骤S32之后W及步骤S33之前，还包括对带接头修复双链cDNA进 行片段大小选择的步骤，优选采用磁珠对带接头修复双链cDNA进行片段大小选择。
[0016] 应用本发明的技术方案，通过在利用待测物种的去除rRNA后的总RNA进行转录组 文库构建之前，增加了对待测菌种的总RNA是否存在污染的鉴定步骤，通过增加对总RNA进 行质控的步骤，在确定所欲构建转录组文库的RNA样品不存在污染的情况下，再进行后续 的转录组文库构建步骤，避免了因RNA存在污染而对建库及后续测序工作造成的人力财力 的浪费，也减少了对后续的测序数据进行分析而产生的不利影响。且该鉴定步骤所需样品 量少，操作简单，在数小时之内即可获得结果，快速准确，同时具有高通量的能力，可W广泛 用于转录组文库构建步骤中待测菌种总RNA污染情况的鉴定。
【附图说明】
[0017] 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0018] 图1示出了根据本发明的一种典型实施方式中转录组文库构建方法的流程示意 图；
[0019] 图2示出了根据本发明的实施例中样品1和样品2中16S rRNA扩增片段的电泳 检测结果图；
[0020] 图3示出了根据本发明的实施例中样品1的16S rRNA扩增片段的测序峰图；
[0021] 图4示出了根据本发明的实施例中样品2中16S rRNA扩增条带的测序峰图；W及
[0022] 图5示出了根据本发明的实施例中总RNA鉴定是否存在污染之后的文库构建方法 的详细流程图。
【具体实施方式】
[0023] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可W相 互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0024] 正如【背景技术】部分所提到的，现有技术中所构建的转录组文库测序后得到的测 序数据的比对率较低，为了改善该一状况，在本发明一种典型的实施方式中，提供了一种 转录组文库的构建方法，如图1所示，该方法包括W下步骤；S1，对待测菌种中总RNA是否 存在污染进行鉴定；S2,从未受污染的待测菌种的总RNA中去除rRNA,得到mRNA和非编码 RNA(non-coding RNA) ;S3,对mRNA和非编码RNA进行转录组文库的构建，得到转录组文库。
[0025] 本发明的上述转录组文库构建方法，通过在利用待测物种的去除rRNA后的总RNA 进行转录组文库构建之前，增加了对待测菌种的总RNA是否存在污染的鉴定步骤，通过增 加对总RNA进行质控的步骤，在确定所欲构建转录组文库的RNA样品不存在污染的情况下， 再进行后续的转录组文库构建步骤，避免了因RNA存在污染而对建库及后续测序工作造成 的人力财力的浪费，也减少了对后续的测序数据进行分析而产生的不利影响。且该鉴定步 骤所需样品量少，操作简单，在数小时之内即可获得结果，快速准确，同时具有高通量的能 力，可W广泛用于转录组文库构建步骤中待测菌种总RNA污染情况的鉴定。
[0026] 本发明的上述方法中的步骤S1的目的是确定待测菌种的总RNA中是否存在污染， 因而任何检测待测序菌种的总RNA是否存在污染的步骤或手段都适用于本发明。在本发明 一种优选的实施例中，上述步骤S1中利用总RNA中的rRNA对待测菌种的总RNA是否存在 污染进行鉴定。利用待测菌种中总RNA中的rRNA来检测是否存在污染，是利用了不同菌种 来源的rRNA中存在一定的特异性序列，根据该特异性序列即可判断判断总RNA是否来源于 同一菌种，进而可W判断该总RNA是否存在其他菌种污染。
[0027] 在本发明的上述构建方法中，根据待测菌种的不同，可W利用的rRNA既可W是原 核生物的16S rRNA,也可W是真核生物的18S rRNA或ITS序列的rRNA。该些rRNA序列中 都存在菌种特异性的序列，因而可W很方便地鉴别菌种来源。
[002引在本发明一种更优选的实施例中，上述步骤S1包括W下步骤；S11，对待测菌种的 总RNA进行反转录，得到cDNA ;S12, WcDNA为模板，对待测菌种的rRNA进行扩增并测序，得 到测序序列；S13,将测序序列与NCBI核巧酸数据库中的参考序列进行同源性比对，得到比 对结果；S14,根据比对结果判断总RNA是否存在污染。该步骤S1通过将反转录后的cDNA 中扩增能够分辨菌种来源的rRNA