Gli2基因作为猪初生重性状相关分子标记及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于猪的分子标记辅助选择技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择 的与初生重性状相关分子标记，同时还涉及一种作为猪标记辅助选择的与初生重性状相关 分子标记的制备方法，还涉及一种作为猪标记辅助选择的与初生重性状相关分子标记的用 途。
【背景技术】
[0002] 猪是重要的经济动物，猪肉由于其肉嫩味美长期W来广受消费者的青睐，是我国 人民动物性蛋白的主要来源之一。近年来，人们对猪肉的消费量与日俱增，如何提高生产性 能、降低生产成本成了猪育种工作者的工作重点之一。
[0003] 分子生物学技术的迅速发展为此提供了重要的契机，凭借该一技术手段，科学家 们发掘出了一大批与猪的初生重，断奶重，产仔数等重要繁殖性状显著关联的分子标记。该 为提高猪的生产性能提供了理论依据，并从实质上使之得到了很大的提高。猪的初生重作 为一个重要的繁殖性状，与猪出生后的生长速度及育成率有着不可分割的密切联系。最近 有很多文献报道了初生重对生长速度的影响，卢伟（卢伟，刘充，于青云，刘巧，孔俊领，王 子荣.不同初生重仔猪0~60日龄生长性能的比较.养猪[J]. 2010. 6)研究发现提高仔 猪初生重，有利于保证仔猪后期快速生长。李剑豪(李剑豪.长白猪初生重对生长速度及哺 育率的影响.仔猪生产[J]. 2006. 18)研究发现长白猪60日龄重与35日龄重均与初生重 呈正相关且初生重与生长速度呈正相关。Beaulieu等（Beaulieu AD,Aa化US JL, Williams NH, Patience JF. Impact of piglet birth weight, birth order and litter size on subsequent growth performance, carcass quality, muscle composition and eating quality of pork[J].J Anim Sci. 2010)研究发现，初生重较低的猪生长速度较慢，从而使 其进入市场的时间增加。另有研究表明仔猪的初生重与育成率亦悉悉相关，初生重在l.OKg W下时仔猪育成率随着初生重的增加而上升；初生重在1. OKg W上时仔猪育成率没有明显 的规律。初生重小于等于0. 5Kg时仔猪育成率仅为55. 56%(高建国.二花脸猪初生重对生 长速度及育成率的影响[J].畜牧与兽医，1992,24 (1);26)。因此，对猪初生重相关基因的 克隆和鉴定可为解释猪和其它哺乳动物胎儿生长发育的遗传机制提供重要线索，并为猪的 繁殖性状遗传改良提供理论依据。
[0004] 化12是调节化化edgehog)信号通路的主要的转录激活子。Hedgehog畑1)家族 分泌信号分子在从果禍到人类的多项胚胎结构的发育图式中起到重要的作用（reviewed by In曲am and McMahon, 2001)。化信号分子与化tched(Ptc)受体结合后抑制其功能， 释放受其抑制的跨膜蛋白Smoothened(Smo)，进而激活细胞内一系列信号级联反应。一个 动物的体形大小通常反映出细胞数目的多少，也就是细胞增殖和细胞死亡的平衡（Raff, M. C.1996.Size control:the regulation of cell numbers in animal. Devell73-175)。 之前的研究表明化信号活性的降低能够引起鼠的形态矮小。在多种组织中，S化都具有 促有丝分裂的作用，如原体节中胚层、视网膜和小脑。另一种化蛋白比h控制软骨的生 长，比h 缺陷小鼠呈现短肢诛儒表型（Quiang,P.T. and McMahon, A.P. 1999. Ve;rtebrate Hedgehog signaling modulated by induction of Hedgehog-binding protein. 化化re397:617-621)。从而影响胎儿发育，进而影响仔猪的初生重。因此本发明拟探讨化12 基因与猪初生重的关系，寻求获得一种与猪初生重性状相关的分子标记。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是在于提供了一种作为猪标记辅助选择的与初生重性状相关分子 标记，DNA标记辅助育种是利用与目标性状基因紧密连锁的DNA分子标记对目标性状进行 间接选择的一种现代育种，该方法是对基因型进行直接选择，与通过表现型间接对基因型 进行选择的传统育种方法相比较，它不受环境影响，不受等位基因显隐关系干扰，结果可 靠；此外，它对目标基因的转移可在育种早期进行选择，从而大大缩短了育种周期，与常规 育种相比可提高育种效率达2-3倍，具有明显的优越性。
[0006] 本发明的另一个目的是在于提供了一种作为猪标记辅助选择的与初生重性状相 关分子标记的债I备方法，CAPs (cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites)CAPs技术又称为PCR-RFLP，限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP)技术。 是用特异设计的PCR引物扩增目标材料时，由于特定位点的碱基突变、插入或缺失数很少， W至无多态出现，往往需要对相应PCR扩增片段进行酶切处理，W检测其多态性。CAPS标记 在二倍体植物研究中可发挥巨大的作用，是PCR标记的有力补充。该种方法与RFLP相比，不 同的是W扩增替代了酶切，避免了 RFLP繁琐的DNA酶切、转移、杂交等步骤。本发明是Gli2 基因在序列表SEQ ID NO ;1的第446bp处有一个G446-A446的碱基突变，导致化oI-RFLP 多态性，为提供了一种作为猪标记辅助选择的与初生重性状相关分子标记的制备方法。
[0007] 本发明的再一个目的是在于提供了一种作为猪标记辅助选择的与初生重性状相 关分子标记的应用，DNA分子标记在动物体内广泛存在，具有个体、种属及品种各层次的特 异性，呈简单孟德尔遗传，不受杂交方式的制约，标记的非等位基因之间无副作用，标记间 无干扰，结果稳定可靠，重复性强，可广泛应用到现实育种工作中。
[0008] 为了实现上述的目的，本发明采用W下技术措施：
[0009] 申请人从报道猪基因化12克隆得到与猪初生重性状相关基因的部分DNA序列，它 的核巧酸序列如序列表SEQ ID NO ;1和图2所述。在序列表SEQ ID NO ;1的第446bp处有 一个G446-A446的碱基突变，导致化oI-RFLP多态性。该个碱基突变位于化12基因第8外 显子中。
[0010] 一种作为猪标记辅助选择的与初生重性状相关分子标记的制备方法，其步骤是：
[0011] A、用猪序列（ensemble收录号；ENSSSCG00000015733)为模板设计引物，提取猪基 因组DNA。
[0012] 1)将大白猪(来自湖北省武汉市华中农业大学精品猪场，为常规推广的外来血缘 的瘦肉型猪种)的肌肉组织在液氮中磨碎，加入等体积IX SET溶液（1ml)，蛋白酶K (lOmg/ 血)至终浓度200 y g/mU十二烷基硫酸轴（即SDS，10% )至终浓度0. 5%，摇匀。55°C水浴摇 床中温育过夜消化。
[0013] 2)将消化后的组织样加入等体积的Tris饱和酷，缓慢颠倒离也管15min，于低温 冷冻离也机中4°C、11000巧m离也lOmin，小也吸取上清液转移至另一离也管中，注意标上 相应的记号。
[0014] 3)加等体积的苯酷/氯仿/异戊醇(体积比25 ;24 ;1)，缓慢颠倒离也管lOmin，于 低温（-9C到+4CTC)离也机中4°C、11000巧m离也lOmin，小也吸取上清，转移至另一个干 净的离也管中。
[0015] 4)加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24 ;1)缓慢颠倒离也管lOmin，于低温 (-91：到+40°〇冷冻离也机中41：、11000巧111离也10111111。
[0016] 5)将上清液吸入标记好的的离也管中，加入2. 5倍体积的预冷无水己醇，即可W 看到白色絮状DNA。
[0017] 6)用枪头将DNA沉淀挑出，置于装有对应号码的EP管中，室温（20 - 25°C，W下 相同）下让己醇挥发干净，加入适量的超纯水(一般300ul左右）溶解DNA。
[001引 7)在DNA浓度测定仪上测定其浓度与纯度，并在（1 %，m/V)琼脂糖凝胶80伏电泳 约化，紫外灯下检测提取的DNA质量。
[0019] B、设计引物，一般原则如下；序列选取应在基因的保守区段；避免引物自身或与 引物之间形成4个或4个W上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构；典型的引物18 到24个核巧长，引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的 可能性。但是长度大于24核巧的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错 误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量；Tm值在55 - 65C (因为6(TC核酸外切酶活性最高)，GC含量在40% - 60% ;引物之间的TM相差避免超过2°C ; 引物的3'端避免使用碱基A，引物的3'端避免出现3个或3个W上连续相同的碱基；为避 免的扩增，引物设计最好能跨两个外显子；引物末端(最后5个核巧酸)不能有超过2个的G 和C。
[0020] 该引物的DNA序列如下所示：正向引物5' -ATGTCCTAAGGAACCAAGCT-3'，反向引物 5' -TCCTGCCTTCTTTTGCTC-3'；
[002。 C、通过PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO ;1和图2所示的 核巧酸序列。
[002引 一、PCR扩增；反应总体积为lOy 1，其中上述制备得到的猪DNA模板0. 5y 1，双蒸 水 7. 0y l，bufferly l，Mg2+0. 6y l，10mM 正向引物和反向引物各 0. 3y l，dNTP0. 2y IJaq 酶0. ly l(10U/y 1)。PCR反应条件为；94°C预变性5min后，循环35次94°C变性30s、57°C 退火30s、72°C延伸25s，最后72°C延伸5min。PCR产物经（2%，m/V)琼脂糖凝胶电泳检测。 [002引程序；94摄氏度预变性5min [0024]
【主权项】
1. 一种GLI2基因作为猪初生重性状相关分子标记，其特征在于：与猪初生重性状相关 的分子标记，其序列为SEQ ID NO :1所示。
2. 权利要求1所述的一种GLI2基因作为猪初生重性状相关分子标记，其特征在于：分 子标记的引物对，其核苷酸序列如下所示： 正向引物：5 ' - ATGTCCTAAGGAACCAAGCT- 3 '， 反向引物：5 ' - TCCTGCCTTCTTTTGCTC - 3 '。
3. 权利要求1所述的一种GLI2基因作为猪初生重性状相关分子标记在猪初生重性状 关联分析中的应用。
4. 权利要求2所述一种GLI2基因作为猪初生重性状相关分子标记，其特征在于：分子 标记的引物对在猪猪初生重性状关联分析中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种GLI2基因作为猪初生重性状相关分子标记及制备方法和应用，其步骤：A、用猪序列为模板设计引物，提取猪基因组DNA。1）将猪的肌肉组织在液氮中磨碎；2）将消化后的组织样加入等体积的Tris饱和酚，冷冻；3）加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，转移另离心管中；4）加入等体积的氯仿/异戊醇，冷冻，离心；5）将上清液吸入标记好的离心管中，加入无水乙醇；6）用枪头将DNA沉淀挑出，加入纯水溶解DNA；7）在DNA浓度测定仪上测定其浓度，紫外灯下检测提取的DNA质量；B、设计引物，获得所示的核苷酸序列。结果可靠，它对目标基因的转移可在育种早期进行选择，大大缩短了育种周期，提高育种效率达2-3倍，具有明显的优越性。
【IPC分类】C12N15-11, C12N15-10, C12Q1-68
【公开号】CN104630210
【申请号】CN201310570912
【发明人】李小平, 金秋实, 余梅, 赵书红, 李长春, 李新云
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2013年11月13日