一种针对miR-99a种子序列的微小反义寡聚核苷酸及应用

文档序号:8313333阅读:519来源:国知局
一种针对miR-99a种子序列的微小反义寡聚核苷酸及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物制备领域,具体设及一种针对miR-99a种子序列的微小反义寡聚 核巧酸及应用。
【背景技术】
[0002] 多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是W骨髓中克隆性浆细胞恶性增殖为主要 特征的恶性肿瘤,MM多伴有复杂的染色体核型异常,基因组不稳定性和结构染色体崎变与 MM患者疾病分期及预后紧密相连。Lionetti等依据遗传学免疫球蛋白重链的易位和细胞 周期蛋白D,即TC(易位/细胞周期蛋白D)将匪患者分为TC1群[t(ll;14)和U6;14) 易位的患者]、TC2群(未发生易位但中低度表达细胞周期蛋白D1的患者)、TC3 (未划分 到其他组的患者)TC4[t(4;14)易位的患者]和TC5[t(6;14)或t(14;20)易位的患者]5 类。将近一半的MM患者是超二倍体伴有奇数染色体和染色体异位,如13号染色体缺失和 免疫球蛋白重链在14q32发生的染色体易位。
[0003] 研究表明染色体异常和其他类型的遗传或表观遗传改变可能导致癌症中的miRNA 下调。在肿瘤中显著过表达的miRNA可W作为一个新型的致癌基因,并称为"oncomiR",该 些oncomiR通常通过负调节抑癌基因基因促进肿瘤发生。因此,改变oncomiR的表达是一 种很有前途的癌症治疗策略。
[0004] miRNA在基因表达调控中扮演着重要的角色,参与生命过程中一系列的重要进程, 包括细胞增殖分化和调亡,个体发育,机体代谢及免疫调节。miRNA能与祀mRNA的特异性结 合从而改变蛋白质的表达,基于其作用机制miRNA既能发挥抑癌基因的作用也能起到致癌 基因的作用。

【发明内容】

[0005] 为了克服现有技术的缺点与不足,本发明的首要目的在于提供一种针对miR-99a 种子序列的微小反义寡聚核巧酸。
[0006] 本发明的另一目的在于提供上述针对miR-99a种子序列的微小反义寡聚核巧酸 的应用。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现:
[000引一种针对miR-99a种子序列的微小反义寡聚核巧酸(tiny antimiR-99a, t-antimiR-99a),其核巧酸序列如下;5' -TACGGGTT-3' ;
[0009] 所述的针对miR-99a种子序列的微小反义寡聚核巧酸经过锁核酸修饰;
[0010] 所述的针对miR-99a种子序列的微小反义寡聚核巧酸在制备抗肿瘤药物中的应 用;
[0011] 所述的抗肿瘤药物优选为抗多发性骨髓瘤药物;
[0012] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[001引 (l)miRNA种子序列通过与其祀基因的mRNA的3' UTR进行碱基完全互补配对,促 进祀基因mRNA降解或抑制mRNA翻译。针对miRNA种子序列反义核酸可W干扰miRNA与祀 mRNA的配对。本发明提供的针对miR-99a种子序列的微小反义寡聚核巧酸作用于多发性骨 髓瘤细胞RPMI-8266中的miR-99a,本发明探究了微小反义寡聚核巧酸t-antimiR-99a对多 发性骨髓瘤细胞的抑制效应,为肿瘤基因治疗寻找新的方法,同时也为传统的抗肿瘤机制 提供新的视角。
[0014] 似相对于成熟miRNA而言,本发明提供的针对miR-99a种子序列的微小反义寡聚 核巧酸t-antimiR-99a具有分子量小,毒性小,特异性强,转染效率高等优点,可用于肿瘤 的实验治疗研究,有一定的药物开发前景。
【附图说明】
[0015] 图 1 是 miR-99a 和 t-antimiR-99a 的序列不意图。
[0016] 图2是miRNA巧片分析小窠碱处理的RPMI-8266细胞miRNA族的结果分析图,其 中,A ;巧片分析结果;B ;miR-99a~12化族成员,其中miR-99a是其中一个成员。
[0017] 图3是miRFocus软件分析miR-99a参与的信号通路的结果分析图。
[001引图4是转染t-antimiR-99a对RPMI-8266细胞colony影响的结果分析图,其中, A ;不同处理组显微镜下的集落形态巧:不同处理组的细胞克隆数统计分析。
[0019] 图5是转染t-antimiR-99a对RPMI8266细胞调亡影响的结果分析图。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限 于此。
[0021] 本实施例中的数据W均数+标准差(mean±SD)表示,使用SPSS13. 0统计软件, 采用单因素方差分析法(one-way AV0NA)分析各组数据差异的显著性。WP<〇. 05为有显 著性差异。
[0022] 实施例1微小反义寡聚核巧酸的设计与合成
[0023] 从 miRBase 数据库中(http: //www. mirbase. org/)获取人 microRNA-99a (序 列号;M1000 OIOI)的种子序列,根据序列互补原理设计针对种子序列的微小反义 寡聚核巧酸序列(t-antimiR-99a),并采用BLAST软件分析确定其反义寡核巧酸序 列及随机对照序列(图1)。针对miR-99a种子序列的微小反义寡聚核巧酸序列: t-antimiR-99a(5'-TACGGGTT-3'),随机序列(scramble, SCR) ;5' -TCATACTA-3' (8bp); 均由上海生物工程有限公司合成锁核酸修饰,高效液相色谱(hi曲perhrmance liquid chromatography, HPLC)纯化。
[0024] 实施例2细胞培养
[0025] 将RPMI-8266细胞(多发性骨髓瘤细胞,购买于中国科学院上海细胞生化所)接 种于含体积分数为10%的胎牛血清,无抗生素的RPMI-1640培养基中,置于37°C、体积分数 为5%的C〇2培养箱,饱和湿度下培养。每2~3天换液传代。实验选用对数生长期、质量 分数为0. 2 %的台盼藍拒染率>95 %的细胞。
[0026] 实施例3小窠碱调节多发性骨髓瘤细胞系中的miRNA族的表达
[0027] 根据之前的研究(Luo X, Gu J, Feng M,化U X, Li Y and Fei J*. Integrative analysis of differential miRNA and functional study of miR_21by seed-targeting inhibition in multiple myeloma cells in response to berberine.BMC Systems Biology2014化 1 7 ;8:82. doi : 10. 1186/1752-0509-8-82.),本实施例选择终浓度为 75 u M 的小窠碱炬BR)处理实施例2培养得到的RPMI-8266细胞4她,然后按照miRVanaTM miRNA 分离试剂盒(Ambion,Austin USA)的说明书,分离RPMI-8266细胞的总miRNA。样品经过 切3
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