一种修饰树突细胞以增强对抗原应答反应的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种通过抑制树突细胞值C)中恒定链蛋白（li)的表达来增强其对抗 原细胞应答的方法。
【背景技术】
[0002] 树突细胞值C)是一种专口将抗原呈递给未成熟或者休眠T细胞的细胞，因此在T 细胞、B细胞免疫中都起到重要作用。由肿瘤抗原引起的DC免疫是一种有效的诱导抗肿瘤 免疫的方法。一种将DC与肿瘤抗原装载在一起的有效方法是将DC与重组病毒载体一起转 导或将其转染编码肿瘤抗原的mRNA。已有研究证明，小鼠和人类的DC与mRNA转染在体内 外都能够刺激细胞毒T淋己细胞（CTL)反应。用肿瘤RNA转染的DC治疗荷瘤小鼠后，肿瘤 转移降低，存活率提高。I期临床试验中，通过利用前列腺特异性抗原（PSA)mRNA转染DC治 疗前列腺癌症患者，患者体内的PSA特异性T细胞应答被激活。在小鼠和人体内用mRMA转 染DC来刺激免疫并产生保护性免疫的效果已经得到证实。将mRNA转染DC技术的关键优 势在于，mRNA可W从几个细胞中放大并由此有足够的，可能是无限的抗原从少量的肿瘤组 织产生。因此，用肿瘤衍生的mRNA转染的DC接种提供了一种有效且可W广泛应用的治疗 转移癌方式，该方法不需要每个病人的相关抗原特征，也不会受到抗原制备所需的肿瘤组 织的限制。
[0003] 在抗肿瘤免疫反应中，CD8+细胞毒T细胞是一个重要的效应器，诱导强有力的CTL 反应已经发展为癌症免疫治疗的一个主要目标。然而，越来越多的证据有力地表明，在肿瘤 免疫中CD4+T细胞的反应也起到了关键作用，CD4+T细胞为CD8+T细胞CTL的诱导，持久性 和扩展提供了重要作用。此外，CD4+T细胞通过分泌效应细胞因子，如IFN-y，使肿瘤细胞 对CTL敏感而胞溶。CD4+T细胞在肿瘤部位刺激免疫系统并抑制局部血管生成。CD4+T细 胞反应在肿瘤免疫中的重要性已在小鼠研究中得到证明；CD4+T细胞在缺少CD8+T细胞的 情况下可W消除肿瘤。在抗肿瘤反应中，CD4+T细胞可能构成了占主导地位的效应臂。因 此，最佳的抗肿瘤免疫反应可能需要同时激活的CD4+和CD8+T细胞的免疫反应臂。
[0004] 内源表达的抗原，如DC表达的抗原与mRNA共转染，将被优先引导到I类加工途径 W激活CD8+T细胞的免疫反应臂。在细胞质内合成后被运送到溶酶体内的抗原的亚型可产 生用于装载II类分子的小肤，刺激微弱的CD4+T细胞反应，接种mRNA转染DC通常不会产生 强有力的CD4+T细胞反应。M肥I类阴性肿瘤细胞与II类cDNA表达质粒转染增强了小鼠 的抗肿瘤免疫原性，该可能是由从呈递II类限制抗原获得的能力并刺激肿瘤特异性CD4+T 细胞应答引起的。恒定链的共表达、II类反式作用因子（CIITA)或者用IFN-y作用于肿 瘤细胞能够废除II类转染肿瘤细胞的免疫原性。该可能是由于在许多肿瘤细胞中，CIITA 的表达或者IFN-y的赔育同时上调了 II类小肤和恒定链的表达。该一结果反映了 li的 自然作用是用来防止内涵体或高尔基体中内源性派生II类小肤与新生的II类分子产生联 系。该个结果与在缺少li的情况下，内源性小肤的呈递更受到能表达II类分子的细胞青 睐的结果保持一致。
[0005] 已有专利公开了一种逆转录基因结构，它可与恒定链mRNA杂交并抑制其翻译。对 于抗原呈递细胞，尤其是恶性抗原呈递细胞，如白血病，淋己瘤，黑色素瘤，该基因结构很有 效性。另有专利公开了 MHC II类抗原呈递细胞含有能抑制li蛋白表达的寡核巧酸。该些 方法对增强内源性抗原的血1C II类呈递很有效，但对于抗原呈递细胞自然产生的抗原却缺 乏效果。因此，需要开发一种新的能够增强DC细胞对抗原刺激应答产生的方法，W应对各 种各样的肿瘤和传染性病原体的抗原决定簇。
【发明内容】
[0006] 本抗原搭载的DC能被用于激发对抗传染性因子和肿瘤的保护性免疫。用编码期 望得到的抗原的核酸转染DC，该DC表达的抗原能够优先进入I类处理程序W产生有效的 CD8+细胞毒T淋己细胞（CTL)应答。CD4+T细胞应答的产生则受到限制。该发明提供了一 种用抗原搭载的DC来增强其对抗原刺激应答的产生方法，该DC的恒定链表达受到抑制。
[0007] 本方法所用DC可W是从病人自身提取的，也可W从配对的捐献者或者体外细胞 培养中获得。
[0008] 本发明提供的可增强对抗原刺激应答的方法和反义结构可W优先刺激CD8+T细 胞应答。该是用恒定链抑制剂处理DC达到的。恒定链抑制剂包括任何可W影响DC中li 的数量和活性的试剂。Li抑制剂可能通过li的表达下降或者防止li和MHC II类分子的 相互作用来发挥作用。
[0009] 通过将反义寡核巧酸或者反义结构和DC共同赔育，可W将其通过自然吸收导入 DC内。也可通过脂类/脂质体，电穿孔或者其他方式辅助吸收。
[0010] 根据本发明，DC能够首先被抗原搭载，或者li抑制剂能首先被引入。或者该两个 可W同时发生。
[0011] 被导入DC的li抑制剂的数量能够根据抑制剂和DC的性质决定。本领域技术人 员可W很容易地确定最佳用量。
[0012] 本发明所用的DC对于目前所知的肿瘤治疗或者防止肿瘤的形成具有很好的疗 效。免疫原性组合物包括的DC携带有能够编码一个抗原和一个li抑制剂的核酸，还包括 一个可接受的载体或者辅剂。普遍来说，在肿瘤负荷在低水平时进行治疗最为有效，并持续 治疗直至情况得到改善。然而，即使肿瘤已经形成了，本发明所提供的方法仍然适用。用本 发明的方法治疗一名病人时，理想的治疗剂量决定于病人的体重，癌症的严重性，抗原的性 质等因素。病人使用DC的药学可接受剂量是10 6-107个细胞/kg体重。细胞可通过癌症治 疗常用的注射方式注入病人体内。本领域技术人员可W通过监测患者的疾病症状，容易地 确定治疗该患者的最佳剂量和并相应地调整治疗手段。该治疗手段还包括注射有丝分裂原 或者淋己因子来增强T细胞增殖。本发明提供的方法还可用于与其他癌症治疗手段，如放 疗、化疗等联合使用。
[0013] 在本发明的一个示例性实施例中，用能够编码至少一个肿瘤抗原的mRNA转染DC。 DC可用完整的肿瘤mRNA转染。恒定链的功能或者表达被抑制，W增强MHC II类分子相关 肿瘤抗原表位的呈递。在一个实施例中，反义RNA或者RNAi阻断了 li的mRNA翻译。
[0014] 本发明中的修饰的DC可能对某些自身免疫性疾病的治疗也有效果。有文献报道 基因修饰1 i蛋白，如化IP核也区域被T辅助细胞表位取代了的髓銷碱性蛋白，可W在体外 通过HLA-DR表达细胞系处理并呈递给T细胞克隆。当修饰的蛋白通过腹腔注射W耐受性 的方式释放，该蛋白消除抗原特异T细胞增殖的能力比消除等量的肤的能力更强。他们在 体内实验中有了类似的发现，通过蛋白的耐受诱导有效地防止蛋白质的自身免疫反应的后 续演变。对自体抗原的耐受已被证明主要是由一个被称为调节性CD25+CD4+T细胞的CD4+T 细胞亚群操控的。因此，用li活性已被改变的编码自体抗原的mRNA转染DC可能对调节性 T细胞的产生是有利的。
[0015] 显而易见，本发明的免疫原性组合物和方法对于人和动物的免疫应答的修饰和疾 病治疗是有效的。本文所用的术语"免疫原性"是指在免疫应答中的移位。某些免疫细胞 的数量或者活性可能被增强或者减弱，或者有可能涉及细胞类型的接入。
[0016] 本发明还提供了一套制备DC的工具，包括抗原编码mRNA和li抑制剂，还有促进 抗原编码mRNA和li抑制剂吸收的试剂，还包含有用法指示。在一个优选的实施方案中，使 用的是肿瘤mRNA。
[0017] 上述公开概括地描述了本发明。通过参考下列具体实施例可W获得更完整的理 解。描述该些实施例仅用于说明的目的，而不是为了限制本发明的范围。拟在形式和等同 替代变化的情况下可能会建议或撞染权宜。虽然本文已经采用特定的术语，但该样的术语 意在描述性的意义，而不是为了限制的目的。本发明涉及但未清楚描述的免疫学和分子生 物学方法，在科学文献中已有报道，对于本技术领域的技术人员来说是公知的。
【附图说明】
[0018] 下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0019] 图1A是用流式细胞分析绿色英光蛋白佑FP)转染细胞。
[0020] 图1B是将卵清蛋白（OVA)mRNA或者GFP的mRNA通过电穿孔导入DC后，DC中的 主要I类M肥限制的OVA表位的呈递。
[002。 图2A是和反义寡核巧酸（AS 0DN)共同赔育W抑制DC的恒定链表达仰74)。
[0022] 图2B是用阳标记的抗CD II C和FITC标记的抗〔074，〔040，〔080，〔086或者血柏 II类抗体（I-Ab)对DC进行双染色。
[0023] 图3A是主要M肥II类限制的OVA表位的呈递。
[0024] 图3B是通过对应的T细胞杂交瘤阐述主要MHC I类限制的OVA表位的呈递。
[00巧]图4A是用OVA的mRNA转染的DC免疫小鼠W诱导CD4+T细胞应答。
[002引图4B是用OVA的mRNA转染的DC免疫小鼠W诱导细胞毒T淋己细胞（CTL)应答。
[0027] 图5A是用li的AN 0DN处理的DC来免疫小鼠，W增强保护性抗肿瘤免疫力。
[0028] 图 5B 是用 TRP2mRNA，Flu MlmRNA 或者 B16/F10. 9 肿瘤 RNA 中任意一个，W及 li AS(AE40)或者对照0D化(SE40)转染的DC免疫后，对肿瘤的治疗效果。
[0029] 图6是用1 i的AN 0DN处理的DC来免疫小鼠，对肿瘤消退起到了促进作用。
【具体实施方式】
[0030] 实施例1
[003。 抗原的M肥I类呈递：通过电穿孔技术将GFP mRNA导入到DC中，24小时候用流 式细胞仪检测到GFP的表达。mRNA的电穿孔技术是一种在人源D