一种通过灌溉防治害虫的RNAi技术及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术和农业应用领域，具体地，本发明涉及用于通过灌觀防治害 虫的RNAi技术及其应用。
【背景技术】
[000引大量的研究已经证明，利用RNA干扰（RNAU技术可W实现害虫种类的专一性防 治，因此，该技术的应用不会影响其他生物，是一种环境友好的害虫防治新策略。然而，该技 术在实际应用中还存在一些问题，其中最主要的问题是如何将祀标基因的双链RNA (dsRNA) 准确送到目标害虫体内。目前比较可行的方法有两种：
[0003] -是利用植物表达目标害虫祀基因的dsRNA，当害虫取食该种转基因植物时，可W 将dsRNA摄入体内，从而达到防治害虫的目的。但是，在自然条件下，每种作物都要面对各 种病、虫的侵害，我们不可能把所有的作物都进行转基因操作使其避免多种生物的为害。
[0004] 二是大量生产双链RNA制剂，像化学杀虫剂一样进行喷洒来防治害虫。但是，该 种方法对于一些钻蛙性害虫（如水稻頓虫等）、地下害虫、一些体壁具有蜡质保护层的昆虫 (如褐飞風），或者是隐藏在植物叶片背面、缝隙等处的昆虫，在喷雾的过程中很难被处理 到，达不到防治的效果。
[0005] 此外，对于刺吸式口器害虫，尤其是个体较小但繁殖速度较快的种类（如闽虫、粉 風等），目前尚无较好的祀标基因筛选和应用技术。
[0006] 为了解决上述技术中存在的问题，本领域迫切需要开发一种易于施用、广泛有效 的RNAi应用技术，尤其是针对钻蛙性及针刺式的害虫，从而达到防治害虫、保护作物的效 果。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种基于RNAi技术，针对刺吸式口器及钻蛙性有害昆虫 进行防治的制剂及应用新技术。
[0008] 本发明的第一方面，提供了一种将双链RNA(dsRNA)导入植物的方法，包括步骤： 将所述的双链RNA施用于植物的根部，通过所述植物对双链RNA的根部吸收作用，使得所述 双链RNA被所述植物吸入并输送到除根部之外的植株部分。
[0009] 在另一优选例中，所述双链DNA包括抗虫性双链DNA。
[0010] 本发明第二方面，提供了一种提高植物抗虫性的方法，包括步骤；将抗虫性双链 RNA(dsRNA)施用于植物的根部，使得所述抗虫性双链RNA被所述植物根部吸收，并输送到 除根部之外的植株部分，从而提高植物的抗虫性。
[0011] 在另一优选例中，所述的除根部之外的植株部分包括茎、枝、叶、花、果、或其组合。
[0012] 在另一优选例中，所述的输送是在植株体内进行输送。
[0013] 在另一优选例中，所述的抗虫dsRNA的长度为50-20(K)bp，较佳地为lOO-lOOObp。
[0014] 在另一优选例中，所述的抗虫dsRNA的施用浓度为0. 000 l-5mg/ml，较佳地为 0. 001-lmg/ml。
[0015] 在另一优选例中，除根部之外的植株部分是植株地面或水面部分的上3/4部分， 较佳地是上2/3部分。
[0016] 在另一优选例中，所述的抗虫dsRNA是针对昆虫生长相关基因的dsRNA。
[0017] 在另一优选例中，所述昆虫生长相关基因包括稻飞HP450基因（切P18A1)、稻飞 風駿酸醋酶基因（carboxylesterase，Ces)、或亚洲玉米頓K型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因 (KPIs)o
[0018] 在另一优选例中，所述的昆虫包括鱗翅目、半翅目、双翅目昆虫。
[0019] 在另一优选例中，所述稻飞HP450(切P18A1)基因片段序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0020] 所述稻飞風駿酸醋酶（carbo;sylesterase，Ces)基因片段序列如SEQ ID NO. 2所 /J、- 〇
[0021] 所述亚洲玉米頓的K型丝氨酸蛋白酶抑制剂（KPIs)基因序列如SEQ ID NO. 3所 /J、- 〇
[002引 在另一优选例中，所述的dsRNA如SEQ ID NOs. :4-6所示。
[0023] 在另一优选例中，所述的施用方式包括灌觀、浸泡、德灌、滴灌。
[0024] 在另一优选例中，所述的抗虫包括抗植食性害虫。
[00巧]在另一优选例中，所述的植食性害虫包括刺吸式口器害虫、巧嚼式害虫、钻蛙性害 虫及地下害虫。
[0026] 在另一优选例中，所述刺吸式口器害虫包括水稻褐飞風、白背飞風或灰飞風。
[0027] 在另一优选例中，所述钻蛙性害虫包括亚洲玉米頓、欧洲玉米頓或桃蛙頓。
[0028] 在另一优选例中，所述的植物包括双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。
[0029] 在另一优选例中，所述的植物包括禾本科植物、豆科植物、十字花科植物、茄科植 物及葫芦科植物。
[0030] 在另一优选例中，所述的禾本科植物包括玉米、水稻、大麦、小麦、燕麦、高梁、黑 麦。
[0031] 在另一优选例中，所述的豆科植物包括大豆、花生、蚕豆、魏豆、赤豆、绿豆、班豆、 四季豆和扁豆。
[0032] 在另一优选例中，所述的十字花科植物包括青菜、白菜、花菜、萝K甘蓝。
[0033] 本发明第H方面提供了一种农用组合物，所述的农用组合物包括杀虫有效量的抗 虫性双链RNA和农药学上可接受的载体。
[0034] 在另一优选例中，所述的农用组合物被施用于植物根部。
[003引在另一优选例中，所述dsRNA的施用浓度为0. 0001-5mg/g或0. 0001-5mg/ml，较佳 地为 0. 001-lmg/ml 或 0. 001-lmg/g。
[0036] 在另一优选例中，所述农用组合物中，dsRNA的施用浓度为0. 01-5mg/g或 0. 01-5mg/ml,较佳地为 0. 1-lmg/ml 或 0. 1-lmg/g。
[0037] 在另一优选例中，所述的农用组合物为液态或固态。
[0038] 在另一优选例中，所述药学或农药学上可接受的载体包括水、增效剂、表面活性剂 或稳定剂。
[0039] 在另一优选例中，所述农用组合物还包括RNA稳定剂。
[0040] 在另一优选例中，所述RNA稳定剂包括盐酸氯脈，RNA保护剂，去离子的甲醜胺等 溶剂。
[0041] 本发明第四方面，提供了一种抗虫性双链RNA序列的用途，用于制备通过根部施 用从而提高植物抗虫性的组合物。
[0042] 本发明第五方面，提供了一种分离的多核巧酸，所述的多核巧酸选自下组：
[0043] (a) SEQ ID NO. : 1-6 任一所示的序列；
[0044] 化）与（a)限定的序列互补的多核巧酸；或
[00