一种l-氨基酸生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种k氨基酸生产方法。
【背景技术】
[0002] 目前世界上可用发酵法生产的氨基酸有20多种。氨基酸a碳原子分别W共价键 连接氨原子、駿基和氨基及侧链。侧链不同，氨基酸的性质不同。氨基酸被广泛应用于食 品、饲料、医药工业，包括：强化食品增鲜剂（赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小麦中）；谷氨酸单 轴和天冬氨酸、苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肤甜味剂（a -天冬醜苯丙氨酸 甲醋）；甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料；多种复合氨基酸制剂可通过输液治 疗营养或代谢失调。
[0003] 氨基酸的生产方法有多种，包括直接发酵法、酶法（利用微生物细胞或微生物产 生的酶来制造氨基酸）、提取法（蛋白质水解，从水解液中提取）等等。传统的提取法、酶法 和化学合成法由于前体物的成本高，工艺复杂，难W达到工业化生产的目的。随着载体、受 体系统的构建及体外基因重组技术的日益完善，氨基酸生物工程菌的构建有了进一步的发 展。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种k氨基酸生产方法。
[0005] 在本发明的第一方面，提供一种提高k氨基酸生产菌的k氨基酸产量的方法，所 述方法包括：在心氨基酸生产菌中提高谷氨醜胺酶YbaS的表达或活性；例如，在k氨基酸 生产菌中过表达（外源的）谷氨醜胺酶孔aS ;培养该菌株，从而生产k氨基酸。
[0006] 在一个优选例中，所述的心氨基酸包括（但不限于）赖氨酸色氨酸，心苏 氨酸。
[0007] 在另一优选例中，所述的谷氨醜胺酶孔aS的氨基酸序列为；（a)GenBank登录号： NP_415018. 1 ;或其同功能变体，如将（a)多肤经过一个或多个（如1-20个；较佳地1-10 个；较佳地1-4个；更佳地1-3个；更佳地1-2个）氨基酸残基的取代或添加而形成的，且 与（a)多肤同功能的多肤。
[000引在另一优选例中，所述方法包括：
[0009] (a)提供一种重组质粒，所述重组质粒中包含一重组表达盒，该重组表达盒含有： 谷氨醜胺酶孔aS编码基因；和
[0010] 化）将（a)的重组质粒转化心氨基酸生产菌，从而提高谷氨醜胺酶孔aS的表达或 活性；
[0011] (C)培养（b)菌株，从而生产k氨基酸。
[0012] 在另一优选例中，所述的k氨基酸是k赖氨酸，k赖氨酸生产菌是包含pDCtet 质粒和pD化an质粒的大肠杆菌；或
[0013] 所述的k氨基酸是k色氨酸，k色氨酸生产菌是CIBTS2 ;或
[0014] 所述的k氨基酸是心苏氨酸，k苏氨酸生产菌是包含（外源的）ppc、aspA、 pntAB、t虹A*基因的大肠杆菌（较佳地为MG1655)。
[0015] 在另一优选例中，所述的心氨基酸生产菌是MG1655。
[0016] 在本发明的另一方面，提供谷氨醜胺酶孔aS的用途，用于提高k氨基酸生产菌的 k氨基酸产量。
[0017] 在一个优选例中，所述的心氨基酸包括（但不限于）赖氨酸色氨酸，心苏 氨酸。
[0018] 在本发明的另一方面，提供一种重组的k氨基酸生产菌，所述的k氨基酸生产菌 中谷氨醜胺酶孔aS高表达或高活性。
[0019] 在一个优选例中，所述的心氨基酸生产菌的基因组中整合有外源的谷氨醜胺酶 孔aS编码基因。
[0020] 在本发明的另一方面，提供一种用于生产心氨基酸的试剂盒，所述的试剂盒中包 括所述的重组的k氨基酸生产菌。
[0021] 在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括：
[002引 k氨基酸生产菌的培养基；或
[002引表达诱导剂（如IPTG)。
[0024] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[00巧]图 1、pTrc-ybaS 酶切图谱。1 ;pTrc-ybaS 利用 EcoRV 酶切，得到约 1. 3化/4. lk:b 片段；M ;marker。
[0026] 图2、pTrc-y油S质粒图谱。
[0027] 图3、pT虹质粒质粒图谱。
【具体实施方式】
[0028] 本发明人经过深入的研究，首次掲示一种通过在心氨基酸生产菌中增加谷氨醜 胺酶YbaS的表达或活性，提高k氨基酸（如k赖氨酸、k苏氨酸、k色氨酸）产量的方 法。所述方法可显著提高心氨基酸的产量。
[0029] 如本文所用，"外源的"或"异源的"是指相对于细胞而言，所述的谷氨醜胺酶YbaS 编码基因并非来自于其本身，而是通过重组方法构建插入。
[0030] 所述的氨基酸生产菌"是指在适当的培养条件下，可重组表达生产k氨基酸 的菌株，较佳地所述菌株是大肠杆菌。现有技术中已经构建了一些k氨基酸生产菌株，该 些菌株均可应用于本发明中。并且，本领域技术人员均了解常规的k氨基酸如心赖氨酸， k色氨酸，k苏氨酸生产菌株的构建方法。
[0031] 对于k氨基酸在大肠杆菌中的生产通路，本领域技术人员具有一定水平的了解。 因此，人们知道如何选择氨基酸生产菌"，例如，在EP1253195、EP1477564中，报道了一 些心氨基酸生产菌的构建。
[0032] 作为本发明的优选方式，所述的k氨基酸生产菌是大肠杆菌，较佳地所述大肠杆 菌中W下的一个或多个基因被弱化或表达降低；a.编码己醇脱氨酶的a化E基因；b.编码 己酸激酶的ackA基因；C.编码磯酸己醜转移酶的pta基因；d.编码乳酸脱氨酶的1化A基 因；e.编码甲酸转运蛋白的化cA基因；f.编码丙丽酸甲酸裂解酶的pflB基因；g.编码丙 丽酸氧化酶的poxB基因；h.编码天冬氨酸激酶1/高丝氨酸脱氨酶I双功能酶的t虹A基 因；i.编码高丝氨酸激酶的t虹B基因；j.编码赖氨酸脱駿酶的IdcC基因；或h.编码赖氨 酸脱駿酶的cadA基因。
[0033] 作为本发明的优选方式，所述的心赖氨酸生产菌（大肠杆菌）中选自W下的一个 或多个基因被增强或过表达；a.编码解除赖氨酸反馈抑制的二氨二化巧合成酶的dapA基 因；b.编码二氨二化巧二駿酸还原酶的da地基因；C.编码二氨基庚二酸脱氨酶的cklh基 因；d.编码四氨化巧二駿酸玻巧醜酶的dapD和编码玻巧醜二氨基庚二酸脱醜酶的dapE ; e.编码天冬氨酸-半酵脱氨酶的asd基因；f.编码磯酸帰醇丙丽酸駿化酶的卵C基因；或 g.编码烟酸胺腺嘿岭二核巧酸转氨酶的pntAB基因。
[0034] 作为本发明的优选实施方式，所述的心赖氨酸生产菌是包含pDCtet质粒和 pD化an质粒的大肠杆菌。当生产心色氨酸时，所述的心色氨酸生产菌是CIBTS2。当生产 k苏氨酸时，所述的k苏氨酸生产菌是包含外源的PPc、aspA、pntAB、t虹A*基因（编码SEQ 10^:24的多肤）的大肠杆菌（较佳地为161655)。卵(3、3394、911148、1虹4*(1虹4定点突 变G433R)等基因均是本领域公知的基因。
[00巧]NCBI已公开了"谷氨醜胺酶孔aS"的序列，例如其序列可参见GenBank登录号 NP_415018. 1 所示。
[0036] 本发明的"谷氨醜胺酶孔aS的编码基因"的核巧酸全长序列或其片段通常可W用 PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关 核巧酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员 已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。
[0037] 为