板栗过敏原的恒温扩增检测引物、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术及食品安全检测领域，涉及食品中过敏原成分的检测 方法，具体涉及板栗过敏原的恒温扩增检测引物、试剂盒及方法。
【背景技术】
[000引板栗又名栗、中国板栗，是壳斗科栗属的植物。板栗是 常见的、广泛食用的树生坚果，板栗引起的过敏症状包括面部红肿、眼睛痛、红、痒、専麻疹、 哮喘、嘴唇红肿、恶也反胃、腹痛、低血压、头晕等症状，因而属于食品过敏原标识管理的重 要种类。国际食品法典委员会制定的国际标准CODEX STAN 1-1985《预包装食品标签通 贝1J》明确规定了树生坚果及其产品必须在预包装食品标签上予W声明。在国际标准的基础 上，世界各国纷纷颁布了各自的法规标准，对树生坚果过敏原成分的标识管理进行了详明 的规定。欧盟委员会指令2007/68/EC和美国《食品过敏原标识和消费者保护法案》（The Food Allergen L油eling and Consumer Protection Act, FALCPA)均明确规定树生坚 果属于必须明确标识的食品过敏原。我国在各级食品标准中也做出了类似的规定，例如《 GB 7718-2011预包装食品标签通则》、《GB/T 23779-2009预包装食品中的致敏原成分》、《 DB11/Z 521-2008奧运会食品安全食品过敏原标识标注》、《DBJ 440100/T 28-2009亚运 会食品安全食品过敏原标识标注》均对此有明确的规定。
[0003] 食品过敏原标识管理的有效实施，依赖于完善的技术监控手段。其中，食品过敏原 检测技术是必不可少的一个组成部分。食品过敏原的检测技术主要分为两类，一类是基于 蛋白质的检测方法，一类是基于基因的检测方法。到目前为止，国内外都没有发布过板栗过 敏原成分的标准检测方法，也尚未建立任何达到行业应用水平的通用方法。该种现状已经 严重影响了板栗过敏原标识管理规定的科学有效实施。
[0004] 基于蛋白质的检测方法在技术上存在明显的局限性，并不能完全满足食品行业生 产管理和监管部口技术监督的需要。基于蛋白质的检测技术局限性表现为；现有研究结果 表明食品过敏原中能够引起过敏反应的蛋白质组成复杂，板栗中存在的过敏原蛋白质组成 尚未完全调查清楚，因此W过敏原蛋白质为检测目标物质建立的蛋白质检测技术得到的检 测结果存在与实际致敏效应发生偏差的可能性；基于免疫学原理的蛋白质检测技术对检测 样品提取物的背景干扰具有较高的要求，与此同时由于预包装食品种类、配料成分、加工工 艺千差万别造成背景干扰非常复杂，极大局限了板栗过敏原蛋白质免疫检测方法的实际应 用效果。此外，相对于核酸而言，板栗过敏原蛋白质容易在食品加工过程中发生变性，对基 于免疫学原理的蛋白质检测技术造成不可忽略的性能下降。
[0005] 相比之下，基于基因检测的方法W食品过敏原的特异性基因片段为检测对象，通 过食品中是否存在过敏原所属物种的保守基因片段来判断是否含有某种特定的过敏原成 分。由于核酸的稳定程度比蛋白质高，在食品加工过程中不易被破坏，因此该类技术可W更 加稳定的检测出微量的过敏原成分。现有常用的基因检测方法为实时英光PCR法，但是该 方法需要使用大型的仪器设备、耗时长、对技术要求高、成本昂贵，并不适用于基层实验室 的推广应用。
[0006] 环介导恒温基因扩增技术化oop-Mediated Isothermal Amplification, W下简 称恒温扩增法）是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，是一种简 便、快速、高特异的基因扩增法，不需要昂贵的特殊设备。与实时英光PCR方法相比成本更 为低廉、操作更为简便，更加适合基层实验室推广应用。
[0007] 目前尚未有将LAMP法应用于快速检测板栗的试剂盒方法。
【发明内容】
[0008] 本发明的一个目的在于提供一种板栗过敏原的恒温扩增检测方法。
[0009] 本发明的另一个目的在于提供一种用于检测板栗过敏原的恒温扩增试剂盒。
[0010] 本发明的另一个目的在于提供一组用于检测板栗过敏原的特异性恒温扩增引物。
[0011] 本发明所采取的技术方案是： 一种板栗过敏原的恒温扩增检测方法，包括W下步骤： 1) 根据板栗leafy-like protein mRNA特异性序列设计特异性恒温扩增检测引物； 2) 待检样品0臟在上述引物、化^ 2.0 Warmstar DNA聚合酶存在的条件下进行恒温 扩增反应； 3) 根据扩增结果判断待检样品中是否存在板栗过敏原成分。
[0012] 作为优选的，所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示： 外引物 1 ;GGAAAGTGGTGGACGTTGAT (SEQ ID No ;1); 外引物 2 ;GGCAATGTTCTGTACCTGGA (SEQ ID No ;2); 内引物 1 ;CACGATGAAGGGGTGTTCTCGCTGAGTTGGGTGCAGATCATG (SEQ ID No ;3); 内引物 2 ;GGTGAGGTTGCACGCGGAAACACGGCACTGCTCGTAGA (沈Q ID No ;4); 环引物 1 ;CACTTCCAACATTACCATTCATGTC (SEQ ID No ;5); 环引物 2 ;GAAGAACGGCCTTGATTACCTC (沈Q ID No ;6)。
[0013] 步骤2)所述恒温扩增反应的体系为；25y L反应体系中含有外引物1和外引物2 各2~lOy ]?、内引物1和内引物2各20~60y ]?、环引物1和环引物2各5~20y 2. 0 Warmstar DM 聚合酶 5 ~10 U、p服.8 的 Tris-肥 1 20 mM、KCl 8 ~12 ml、（NH4)2S04 8 ~12 mM、0. 08 ~0. 12% Tween-20、dNTPs 1.5 ~1.7mM、M拆〇4 0. 6 ~l.OmM、甜菜碱 0. 7 ~ 0. 9M，待检样品DNA 2y L。
[0014] 作为优选的，步骤2)所述恒温扩增反应的体系为；25y L反应体系中含有外引物 1和外引物2各5 y M、内引物1和内引物2各40 y M、环引物1和环引物2各20 y M、化f 2. 0 Warmstar DM 聚合酶 8U、抑8. 8 的 Tris-肥 1 20 mM、KCl 10 mM、（NH4)2S〇4lO mM、0. 1〇/〇 Tween-2〇、dNTPs 1. emM、M拆〇4 0. SmM、甜菜碱 0. SM，待检样品 DM 2 y L。
[0015] 步骤2)所述恒温扩增反应的程序为；63~65 °C恒温反应45~60min。
[0016] 步骤3)可采用曲线法或显色法判断扩增结果，曲线法：在反应体系中恒温加入 1-20 y M SYT0-9使用英光PCR仪或其它恒温英光检测仪进行检测，根据扩增曲线判断结 果，有"S"型扩增曲线的为阳性，无"S"型扩增曲线的为阴性；显色法：在反应体系中加入 500-2000XGeneFinder，根据颜色判断结果，阳性为绿色，阴性为澄色。
[0017] 一种用于检测板栗过敏原的恒温扩增试剂盒，其包括6条根据板栗leafy-like protein mRNA序列设计的特异性恒温扩增检测引物。
[0018] 所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示： 外引物 1 ;GGAAAGTGGTGGACGTTGAT (SEQ ID No ;1); 外引物 2 ;GGCAATGTTCTGTACCTGGA (SEQ ID No ;2); 内引物 1 ;CACGATGAAGGGGTGTTCTCGCTGAGTTGGGTGCAGATCATG (SEQ ID No ;3); 内引物 2 ;GGTGAGGTTGCACGCGGAAACACGGCACTGCTCGTAGA (沈Q ID No ;4); 环引物 1 ;CACTTCCAACATTACCATTCATGTC (SEQ ID No ;5); 环引物 2 ;GAAGAACGGCCTTGATTACCTC (沈Q ID No ;6)。
[001引 所述试剂盒中还包括W下组分:公別2. 0 Warmstar DM聚合酶、p服.8的 Tris-肥 1、KC1、（NH4)2S04、Tween-20、dNTPs、M拆04、甜菜碱、GeneFinder 或 SYT0-9、阳性对 照和阴性对照，所述阳性对照为板栗标准品或含有leafy-like protein基因序列的重组 质粒，所述阴性对照品为dd&O 一组用于检测板栗过敏原的特异性恒温扩增引物，其序列分别如下所示： 外引物 1 ;GGAAAGTGGTGGACGTTGAT (SEQ ID No ;1); 外引物 2 ;GGCAATGTTCTGTACCTGGA (SEQ ID No ;2); 内引物 1 ;CACGATGAAGGGGTGTTCTCGCTGAGTTGGGTGCAGATCATG (SEQ ID No ;3); 内引物 2 ;GGTGAGGTTGCACGCGGAAACACGGCACTGCTCGTAGA (沈Q ID No ;4); 环引物 1 ;CACTTCCAACATTACCATTCATGTC (SEQ ID No ;5); 环引物 2 ;GAAGAACGGCCTTGATTACCTC (沈Q ID No ;6)。
[0020] 本发明的有益效果是： 本发明基于环介导等温扩增技术，根据板栗leafy-like protein mRNA序列设计了 6条特异性引物，能特异性识别祀基因序列上的8个独立区域，启动循环链置换反应，在祀 标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上周而复始形成有很多环的花挪菜结构的茎一环 〇臟混合物。采用特异性引物及一种具有链置换活性的化^ 2.0 WarmStar 0臟聚合酶，在 63~65C对核酸进行扩增反应，反应需在恒温条件下进行，在45~60min的短时间内扩增 效率可W达到1炉~1〇1°个拷贝数。本方法具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、 鉴定简便、适合现场检测等有益效果： (1) 快速高效；整个扩增只用45~60min即可完成，扩增产量可达109~l〇w个拷贝； (2) 操作简便；不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要 一部检测仪就能反应和检测，条件比较温和； (3) 高特异性；本发明根据过敏原的外源基因与内源基因结合处设计了 6条特异性引 物，应用上述6条引物，扩增祀序列的8个区域，具有很强的品系特异性，且非常稳定，形成 引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行； (4) 高灵敏度；最低检测极限可达到10个拷贝； (5) 鉴定简便；加入500-2000XGeneFinder，根据颜色判断结果，阳性为绿色，阴性为 澄色；在反应体系中恒温加入1-20 y M SYT0-9使用英光PCR仪(如AB口500)或其它恒温 英光检测仪（Genie II )进行检测，根据扩增曲线判断结果，适合现场检测。
【附图说明】
[0021] 图1为板栗过敏原特异性恒温扩增引物筛选图(其中A为第一套引物的扩增情况， B为第二套引物的扩增情况，C为第H套引物的扩增情况）； 图2为板栗最佳反应体系实验图； 图3为实施例3灵敏度实验结果（曲线法）； 图4为实施例3灵敏度实验结果(显色法，其中，1-2为100%阳性样品，3-4为10%阳性 样品，5-6为5%阳性样品，7-8为1%阳性样品，9-10为0. 5%阳性样品，11-12为0. 1%阳性 样品，13-14为0. 05%阳性样品，15-16为阴性对照）； 图5为实施例4特异性实验结果（曲线法）； 图6为实施例4特异性实验结果(显色法，其中，1-2为阳性对照，3-4为阴性对照，5-6 为1号样品，7-8为2号样品，9-10为3号样品，11-12为4号样品，13-14为5号样品，15-16 为6号样品，17-18为7号样品，19-20为8号样品，21-22为9号样品，23-24为10号样品， 25-26为11号样品，27-28为12号样品，29-30为13号样品，31-32为14号样品，33-34为 15号样品，35-36为16号样品，37-38为17号样品）； 图7为实施例5实际样品检测结果（曲线法）； 图8为实施例5实际样品检测结果(显色法，其中，1-2为阳性对照，3-4为阴性对照， 5-6为样品1，7-8为样品2,9-10为样品3,11-12