一种分析酱油曲醅中未知微生物的方法

文档序号:8313464阅读:546来源:国知局
一种分析酱油曲醅中未知微生物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明尤其设及一种微生物的分析方法,特别是设及一种分析酱油酷中未知微生 物的方法;具体是设及酱油的生产制曲和发酵过程分析并进行监控外来微生物的污染的方 法,。属于酱油生产领域。
【背景技术】
[0002] 中国传统酱油的生产,制曲及发酵过程都是敞开式的,许多有益的微生物和有害 微生物都参与其中,其所起到的好坏作用不清楚,目前通过传统的培养分析方法只了解到 其中一部分微生物,还有很多有益或有害微生物仍不清楚。因为传统的微生物学研究方法 是借鉴于需要从环境中分离和纯培养微生物,在其形态、生理生化特征和代谢等方面加W 分析。然而,自然界中各种微生物都混杂生活在一起,即使很少量的样品也是许多微生物共 存的群体,要分离某种微生物,首先须使该微生物处于纯培养状态。现有的方法:稀释涂布 平板法、稀释混合平板法或平板划线法是分离和纯化微生物的常规方法,但许多研究已经 证实,该方法一般仅能培养和分离出占总数1%的极少数微生物,由于微生物之间复杂的共 生关系和培养条件,有多达99%的微生物不能在实验室条件下培养和分离,远远不能满足 微生物生态学研究的需要,而且更难W及时有效地跟踪微生物群落结构的变化过程。它最 大的缺点是;即使最复杂的实验组合也不能对分离物进行精确的鉴定,而且不能揭示分离 物之间的系统发育关系,种属分类的准确性不高,导致微生物资源大量丢失。

【发明内容】

[0003] 本发明针对现有传统培养技术存在的问题和酱油发酵过程各种微生物混杂特性, 目的在于客服现有技术的缺点,提供一种种属分类的准确性高的分析酱油曲酷中未知微生 物的方法。
[0004] 本发明适用于所有生产工艺的酱油的各个发酵阶段酱油曲酷中微生物群落分析, 利用构建的细菌leSrDNA V3区通用引物,建立了酱油曲酷中微生物结构的技术分析体系, 具有无需分离培养过程、快速、方便、全面、重复性好等优点。发酵曲料中微生物群落结构和 动力学变化规律可W成为传统酿造业改造的突破口,不仅可W深入分析纯种微生物的发酵 生产工艺,而且能够深入分析传统酿造中的群体微生物在发酵生产过程所起的作用,分析 出影响传统发酵食品的质量问题和安全问题。
[0005] 本发明目的通过如下技术方案实现:
[0006] 一种分析酱油曲酷中未知微生物的方法,包括如下步骤:
[0007] 1)样品的采集;在酱油发酵罐采集样品,在酱油发酵周期分时间段进行采样;
[000引 2)从采集的酱油酷中提取基因组DNA ;
[0009] 3)建立扩增16S rDNA V3可变区的PCR反应体系和反应程序,用琼脂糖凝胶电泳 检测PCR产物,用GelDoc 2000System凝胶成像仪拍照,分析结果;扩增所用的引物为SE化 ID. N01 和沈化 ID. N02 ;
[0010] 4)PCR产物的纯化;
[001U 5)对上述纯化后的PCR产物进行变性梯度凝胶电泳,电泳结束后,用SYBR GREEN 染色,用凝胶成像仪拍照;
[0012] 6)采用如antity one软件对图谱进行多样性分析和聚类分析;
[0013] 7)对图谱上的优势条带和差异条带进行切胶回收;
[0014] 8)对回收条带进行PCR扩增,扩增所用的引物为SE化ID. N03和SE化ID. N02 ;
[00巧]9)扩增产物用来做测序分析,测序反应所用的引物为SE化ID. N03和SEA ID. N02 ;
[0016] 10)所测得的序列经于NCBI上进行Blast比对分析,然后进行同源性分析。
[0017] 进一步地,所述采集样本的采样位置为发酵罐的中层曲膠和顶层曲膠。
[001引所述采用的时间为发酵的第0天、第15天、第30天、第45天、第60天、第75天和 第90天。
[0019] 所述提取基因组DNA用酱油类DNA提取试剂盒提取酱油酷样品基因组DNA,该方法 能较好地去除大豆蛋白,降低盐分和色素的含量。
[0020] 所述步骤(3)中反应体系组成为;总体积50 y 1,包括DNA模板6 y L,正反引物各 luLEx Taq Primx(该混合液包括 Ex 化9、(1肿? Mix1:ure 和 Ex Taq Buffer)25lil,加 dd&O 至 50 y 1。
[002U 所述步骤(3)中PCR的反应程序为降落PCR,预变性94°C 4min,前20个循环为: 94°C变性Imin,65°C退火Imin,每个循环后退火温度下降0. 5°C,72°C延伸Imin ;再于恒定 退火温度下进行10个循环,94°C变性lmin,55°C退火lmin,72°C延伸Imin,最后再72°C延 伸5min,于4°C保存。
[002引 所述步骤(4)采用 TaKaRa 公司的 DNA Rra卵ent Purification Kit Ver. 2. 0 试 剂盒纯化PCR产物。
[0023] 所述步骤(5)中进行变性梯度凝胶电泳的条件为:采用8%的丙締酷胺凝胶浓度, 上样量为20 y以电压60v,60°C,电泳时间为3.化。
[0024] 所述步骤(5)中的染色方法为:将凝胶从玻璃板上剥离,放入1:10000体积比稀释 的SYBRGREEN染色缓冲液中,避光染色20分钟。
[002引步骤做中反应体系组成为;总体积50 y 1,包括DNA模板6 y L,正反引物各1 y L, Ex Taq Primx(该混合液包括 Ex 化9、(1肿? Mix1:ure 和 Ex Taq 6证'日1')25^1,加(1地20至 50 y 1,扩增所用的引物为338F和518R ;
[0026] 步骤巧)中测序反应体系为;Big Dye Seq Buffer (;5X) 2 yL,Big Dye (2. 5 X) 0. 5 y L,测序模板 DNAO. 5 y L,测序引物(10 y M) 0. 5 y L,加 dd&O 至 10 y L,测序 反应所用的引物为338F和518R。
[0027] 相对于现有技术,本发明具有如下优点:
[002引 1)本发明W酱油曲酷为目标物,建立了扩增16S rDNA V3可变区的PCR反应体系 和反应程序,确定了变性梯度凝胶电泳的反应条件,最终建立并优化了酱油曲酷中未知微 生物群落的检测体系。
[0029] 2)本发明适用于酱油曲酷中未知微生物群落分析,成本低廉、具可重复性、可直接 快速分析的优点,无需分离培养的过程,便可获得微生物群落完整的相关信息。
[0030] 3)本发明w微生物的DM序列为对象的分子生物技术,可w大规模地平行处理多 种微生物的种群动态变化规律,该是传统研究技术无法比拟的;酱油制曲和发酵过程中微 生物群落结构和动力学变化规律可W成为传统酿造业改造的突破口,使我们不仅可W深入 研究纯种微生物的发酵生产工艺,而且能够深入研究传统酿造中的群体微生物在发酵生产 过程的作用。通过该些研究,分析出影响发酵制品的质量问题和安全问题。
【附图说明】
[003U 图1为16S rDNA目标片段PCR扩增电泳图;
[003引图2为不同发酵时间样品细菌总DNA的DGGE图谱;
[0033] 图3为不同发酵时期微生物种群多样性聚类分析图。
【具体实施方式】
[0034] 为更好地理解本发明,下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明,但实施 例不构成对本发明保护范围的限定。
[00对实施例
[0036] 一种分析酱油曲酷中未知微生物的方法,包括如下步骤;
[0037] 1、取样品;
[003引由于传统高盐稀态酿造工艺的酱油生产的发酵周期为3个月,因此,共7个采样时 间,分别为;发酵0天、15天、30天、45天、60天、75天及90天。采样位置为发酵罐的中层 曲膠和顶层曲膠。
[0039] 2、总 DNA 提取
[0040] 无菌条件下分别取不同时间采集的样品lOg,加入50mL灭菌双蒸水,摇床振荡 60min。4°C,4000g离屯、15min,取上清于4°C,5000g离屯、lOmin,取上清液,于4°C保存。参 照酱油类DNA提取试剂盒(购自北京鼎国生物技术有限责任公司)说明提取预处理过的样 品,所提取的DNA溶于TE缓冲液,-20°C条件下保存。
[00川 3、PCR - DGGE引物序列
[0042] 引物由上海生物工程有限公司合成,序列如下:
[0043] SEQ. ID. N01 ;引物 338F - GC - clamp ;
[0044] SEQ. ID. N02 ;引物 518R;
[0045] 沈Q. ID. N03 ;引物 338F。
[0046] PCR 引物 338F - GC - clamp(SEQ. ID. NOl)和引物 518R(SEQ. ID. N02)是用来扩增 16S rDNA V3 可变区,引物 338F(SEQ. ID. N03)和引物 518R(SEQ. ID. N02)是用来扩增 DGGE 电泳后切胶回收的产物,同时也作为测序反应的引物。
[0047] 4、16S rDNA V3 片段的扩增
[0048] 50 y 1 的 PCR 反应体系女日下;25 y 1 的 Premix Taq(TaKaRa 公司),模板 DNA 5 y 1, 338F - GC - clamp(SEQ. ID.N01)和引物518R(SEQ. ID. NO。分别作为正、反引物,正反引物 (20yM)各lyl,适量的灭菌双蒸水补足50yl。
[0049] PCR反应程序;PCR反应采用touchd
当前第1页1 2 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1