一种检测奶牛结核易感性的检测标靶及引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学技术领域，设及一种检测奶牛结核易感性的检测标祀及引 物，具体设及通过检测基因SNP位点多态性来判断奶牛对结核的易感性。
【背景技术】
[0002] 奶牛结核病是由牛结核分支杆菌引起的重要的人畜共患的慢性消耗性传染病，曾 被称为"白色癌疫"。由于潜伏期长（1-10年)、缺乏有效的防治手段，既没有有效的疫苗预 防，也没有特效的药物治疗，国内外检出结核病牛，采用的方法均是隔离、扑杀及净化，经济 损失巨大，并带来严重的公共卫生安全隐患，对公共卫生安全带来极大威胁。
[0003] 根据世界卫生组织及粮农组织公布，大约10%人类结核由奶牛结核传染，近年来， 随着结核杆菌耐药菌株的出现，结核病在近年又死灰复燃，全球结核病每年的新增病例约8 百万，每年约有300万人死于结核病，即大约每10秒钟有一个人死于结核病；中国具有远高 于世界平均水平的结核病发病率，是世界上22个结核病高负担国家之一，结核病患者数量 居世界第二位。随着我国近年奶牛业的发展，奶牛结核亦有上升趋势。
[0004] 由于目前对牛结核分枝杆菌的致病机理了解甚少，结核病的防控基础研究受到了 严重制约，进行牛结核病抵抗力和易感性研究，筛选奶牛结核病易感高风险因子，为区分易 感牛群和健康牛群，选择健康牛群有重要意义。
[000引 BoLA即牛白细胞抗原，也就是牛的主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC)，又称主要组织相容性复合基因，包括一系列紧密连 锁、高度多态性的基因座，与机体的免疫系统功能密切相关。BOLA-DRB3. 2基因是牛白细胞 抗原基因的外显子1，位于23号染色体上，所编码的血1C- II分子在免疫系统中发挥着非常 重要的作用。研究表明，BOLA-DRB3. 2基因与家畜的抗病性和易感性有着密切的关系，且现 已发现BOLA-DRB3. 2基因与奶牛对乳房炎等疾病的易感性存在相关性。在对人的HLA基 因与结核相关性研究发现，HLA-DRB基因与人结核病抵抗力存在极大的相关性。但是对于 BOLA-DRB3. 2基因与牛结核易感性相关性的研究很少，需要进一步的实验来确定。
【发明内容】
[0006] 由于目前针对奶牛结核易感性检测的方法很少，所W寻求一种新的、有效的奶牛 结合易感性的检测方法对奶牛结核病净化及健康种群培育具有很大的意义，对于该一问 题，本发明提供了一对检测奶牛结核易感性的引物。
[0007] 本发明采用的技术方案如下； 本发明的第一方面为提供一种用于检测奶牛结核易感性的检测标祀，即BOLA-DRB3. 2 基因。
[000引本发明的第二个方面为提供一种用于检测奶牛结核易感性的引物，即W B0LA-DRB3. 2基因的rs 137786474号SNP位点为检测标祀，根据该SNP位点并距端点 1-lOOObp范围内序列设计引物，所设计引物长度为20-25bp之间，且能测定B0LA-DRB3. 2基 因的基因型。
[0009] 所述的引物是W BOLA-DRB3. 2基因的rsl37786474号SNP位点为检测标祀设计 的，该引物能测定BOLA-DRB3. 2基因的rsl37786474号SNP位点的基因型； 所述的W BOLA-DRB3. 2基因r rsl37786474号SNP位点为检测标祀的设计的引物是； 上游引物；5' - CTCTGTCTGTTGAGCGAAGATG-3 SEQ ID No. 1 ; 下游引物；5' - AGTCACGCATTGACAAAATCAC-3 沈Q ID No. 2 ; 所述W BoLA-DRB3. 2基因rsl37786474号SNP位点的测序引物是； 5' - CTCTGTCTGTTGAGCGAAGATG-3 沈Q ID No. 1。
[0010] 本发明的第=方面是将提供引物运用于奶牛结核易感性检测中。
[0011] 具体包括如下步骤： 步骤（1)，模板的制备；提取被测奶牛的基因组DNA ; 步骤（2)，引物设计；所述的引物为： 上游引物；5' - CTCTGTCTGTTGAGCGAAGATG-3 ; 下游引物；5' - AGTCACGCATTGACAAAATCAC-3。
[0012] 步骤（3)，PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测； 步骤（4)，对琼脂糖凝胶电泳检测无非特异性扩增条带的PCR产物直接测序，对琼脂糖 凝胶电泳检测含有非特异性条带的PCR产物测序经切胶纯化后再进行测序，根据测序结果 对B0LA-DRB3. 2基因的rsl37786474号SNP位点的基因型进行判断； 步骤（5)，判定被测奶牛患结核的风险。
[0013] 上述技术方案中，所述的PCR扩增体系为： Eas}fTaq 酶，5 U/ y L，0. 5 y 1 ; lOXBuffer (含 Mg") 5y 1 ; 上、下游引物，10 pM，各lyl ; dNTPs，2. 5 mM，4y 1 ; 模板DNA，50 ng/uL，4y 1 ; dd&O ：M. 5 y 1 ; 总体积50yl。
[0014] 上述技术方案中，所述的PCR扩增程序为95°C预变性3min，95°C变性45s，58°C退 火45s，72°C延生Imin，进行35个循环(变性-退火-延生)，72°C再延生8min，最后4°C保 存。
[0015] 上述技术方案中，所述的步骤（3)琼脂糖凝胶电泳检测的具体方法如下：配1% (w/ V)琼脂糖凝胶，取5]iL扩增的产物与lyL lOxloading buffer混匀后上样，120V下电泳 25min，紫外判断PCR结果。巧日出现一条专一性条带表示无非特异性扩增，如出现两条或W 上条条带表示出现非特异性扩增） 上述技术方案中，所述的对B0LA-DRB3. 2基因的rsl37786474号SNP位点的基因型的 具体判断方法为：用DNASTAR软件中SeqMan程序对序列的rs 137786474号位点的碱基进行 对比，得出该位点的基因型，基因型分为A/A、A/G和G/G型 上述技术方案中，所述的判定被测奶牛患结核的风险的具体步骤为；BOLA-DRB3. 2基 因rsl37786474号SNP位点的基因型为A/A基因型的牛只患结核性的风险最高，G/G基因 型患结核病的风险为A/A基因型的0. 5-0. 55倍，A/G基因型患结核的风险最低，然后根据 BOLA-DRB3. 2基因rsl37786474号SNP位点的基因型将牛群分类管理。
[0016] 本发明与现有技术相比，其有益效果为： 本发明自行设计引物，Wrsl37786474号SNP位点为标祀设计引物，通过该引物检测奶 牛外周血基因组DNA中的BOLA-DRB3.2基因的多态性，测定各样品的基因型，并通过测定的 基因型来评估奶牛患结核病的风险，对实现个体患结核病预警风险的评估提供W-种新的 方案。
[0017]
【附图说明】： 图1为18头被测奶牛DNA样品的电泳检测图；其中M为化2000分子量标记； 图2为10头被测奶牛DNA样品PCR扩增后的电泳检测图；其中M为化2000分子量标 记。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0019] 本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发 明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件 或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可W通过购买获得的 常规产品。
[0020] 发明人研究发现BOLA-DRB3. 2基因rsl37786474号SNP位点的多态性与奶牛的 结核病的易感性相关，可W对奶牛个体对结核病患病风险进行评估，本发明实现了通过 BOLA-DRB3. 2基因rsl37786474号SNP位点多态性检测奶牛结核易感性。
[002U 对BOLA-DRB3. 2基因rsl37786474号SNP位点基因型检测方法可W采用DM测序 法、限制性酶切片段长度多态性、焦磯酸测序法、Taqman探针法等。
[002引下面通过DNA测序法，对本发明所述引物的运用进行详细介绍。
[0023] 一.实验材料与方法 1.实验材料 1. 1实验样品 W云南省昆明、玉溪和大理地区的奶牛为研究对象，经PPD皮内变态反应试验检测的 阳性样本126份，阴性样本165份，共291份。
[0024] 1. 2实验试剂 全式金全血DNA提取试剂盒、TaKaRa公司DNA胶回收试剂盒。Easy Taq酶购全式 京有限公司，DL 2000Mark购自宝生物工程(大连）有限公司。凝胶成像仪、PCR扩增仪购自 BIO-RAD公司，电泳仪购自北京六一仪器厂。
[0025] 2.实验方法 2. 1样品采集 对经过PPD检测后的牛进行血样采集。阳性样品为两次PPD检测均为阳性的牛只血。 阴性牛为两次PPD试验均为阴性的且与阳性牛同一牛场，同一圈舍，年龄±8岁的牛只的血 样。样品全部为抗凝全血，并于-20°C保存。放入冰盒运回实验室-80°C储存。
[0026] 2.2引物设计 PCR检测BoLA-DRB3. 2基因rsl37786474号SNP位点多态性引物； 上游引物；5' - CTCTGTCTGTTGAGCGAAGATG-3 ; 下游引物；5' - AGTCACGCATTGACAAAATCAC-3。
[0027] 用于BOLA-DRB3. 2基因rsl37786474号SNP位点的测序引物； 5' - CTCTGTCTGTTGAGCGAAGATG-3。
[002引 2. 3全血基因组提取 按照全式金全血DNA提取试剂盒提取DNA说明书要求提取DNA，其方法为： 1.在1.5血EP管中加入200 uL全血。
[0029] 2.加入 20 y L Proteinase K 溶液，混匀。
[0030] 3.加入220 y 1 BB3,充分颠倒混匀，56°C放置10分钟，期间混匀数次，溶液应变 为清亮(如溶液未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止)。加入BB3时可能会产生 白色沉淀，一般56°C放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不 彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。<