用于纯化转基因因子vii的方法
【专利说明】用于纯化转基因因子VI I的方法 发明领域
[0001] 本发明涉及尤其是用于纯化转基因来源的重组人活化因子VII的抗因子VII亲和 配体。组合其他正交色谱步骤的亲和配体允许制备高度纯化的FVII溶液，其被完全活化、 不含聚集体并具有低百分比的降解或氧化的FVII形式。
[0002] 发明背景
[0003] 因子VII (FVII)是一种维生素K依赖性糖蛋白，其活化形式（FVIIa)参与凝结过 程，在钙和组织因子存在下活化因子X和因子IX。FVII是以406个残基的单肽链形式分 泌，具有约50kDa的分子量。FVII包含四个独特结构的结构域：N端Y羧基结构域（Gla)、 两个"表皮生长因子（EGF)-样结构域"以及丝氨酸蛋白酶结构域。FVII向FVIIa的活化表 征为Argl52-Ilel53结构域（精氨酸152-异亮氨酸153)连接的裂解。因此，FVIIa是这 样的化合物：具有分子量约20kDa的152个氨基酸的轻链，并且具有分子量约30kDa的254 个氨基酸的重链，通过单一的二硫键（Cysl35-Cys262)彼此相连。
[0004] 血浆的FVIIa包含几个翻译后修饰：前十个谷氨酸被Y -羧酸化，Asp63被部分 羟基化，Ser52 (丝氨酸52)和Ser60 (丝氨酸60)被0-糖基化并且分别携带葡萄糖（木 糖）0-2和岩藻糖型，Asnl45 (天冬酰胺145)和Asn322 (天冬酰胺322)主要通过二触角 (biantennary)二唾液酸化（bisialylated)的复杂结构被N-糖基化。
[0005] FVII用于治疗表现为因子VIII (A型血友病）或因子IX (B型血友病）缺陷的血友 病患者，以及表现出凝固因子的其他缺陷的患者，例如，FVII的先天性缺陷。因此有必要获 得注射用FVIIa浓缩物。
[0006] 获取FVIIa浓缩物的最古老的方法是从通过血浆分级得到的血浆蛋白质中纯化 FVIIa。为这一目的，EP 0 346 241描述了富含FVIIa的级分的制备，其在吸附、接着洗脱包 含FVII和FVIIa以及其他蛋白质如因子IX(FIX)、X(FX)和II (FII)的血浆蛋白质的分级 二级产物，特别是PPSB的预洗脱液（P =凝血酶原或FII，P =前转变素或FVII，S =斯图亚 特因子或FX，以及B =抗血友病因子B或FIX)后获得。这种方法的缺点在于获取的FVII 仍然含有一些痕量的其他凝固因子。
[0007] 同样地，文献EP 0 547 932描述了基本上不含维生素K依赖因子和FVIII的高纯 度FVIIa浓缩物的制备工艺。通过这一工艺获得的FVII，不管其纯度，但仍表现出残留的血 栓形成活性。
[0008] -般而言，这些方法的主要缺点之一是它们只能产生小量的产物。此外，还难以获 取完全不含在血浆中存在的其它蛋白质的产物。最后，尽管在制备血浆凝固因子的每个阶 段都实施了一些预防措施来确保它们的病毒和细菌安全性（随访献血者、检测已知病毒和 细菌污染的测试、严格的纯化和病毒失活处理以尽可能减少传输血液传播致病物的危险）， 然而，并不完全排除致病物污染的风险。此外，克罗伊茨费尔特-雅各布病的新变种的出现 造成了通过血液产品非常规致病物传播的恐惧。此外，从献血者采集的血浆体积仍然有限。
[0009] 因此，自从二十世纪八十年代，编码人因子VII的DNA被分离出来（Hagen等人； Proc. Natl. Acad. Sci.，1986, 83 (8) : 2412-6)，并在各种表达体系中表达。
[0010] 已进一步描述了多种用于重组因子VII的纯化的工艺（参见例如 W02009/141418)。目前的重组因子VII多肽通常是由一个或两个不同的多步工艺纯化，或 者只采用在常规树脂上的色谱，或者包括使用具有蛋白质配体的亲合树脂的亲和色谱。
[0011] 重组因子VII可以通过分批发酵或由转基因哺乳动物产生。特别地，描述了在雌 兔的乳腺中产生的FVII组合物，例如在专利申请W02007/138199中。通过转基因哺乳动物 在乳中产生的FVII然后可从乳中纯化，例如通过切向过滤和色谱，或通过钙沉淀，随后数 个色谱步骤。
[0012] 然而，可用的纯化方法并非没有缺点。尤其是可能仍然存在来自转基因哺乳动物 的天然蛋白质，特别是来自转基因哺乳动物的天然因子VII，这会在向人类患者给药时触发 免疫原性。
[0013] 发明概述
[0014] 本发明的一个目的是一种从源生物材料纯化转基因因子VII (TgFVII)和/或转基 因活化因子VII (TgFVIIa)的方法，包括亲和色谱的步骤，该亲和色谱包括步骤：
[0015] (a)在允许TgFVII和/或TgFVIIa结合配体的条件下，使含有TgFVII和/或 TgFVIIa的源生物材料接触对TgFVII和/或TgFVIIa特异的配体，和
[0016] (b)通过以非破坏性的方式打断与所述配体的相互作用，回收TgFVII和/或 TgFVIIa。
[0017] 在本发明的实施方案中，配体是针对至少一种TgFVII和/或TgFVIIa表位，或其 功能片段或衍生物的抗原结合蛋白质。优选地，配体包括形成两个完整的抗原结合位点的 两条重多肽链且缺乏轻多肽链，并且是源自骆驼科的免疫球蛋白重链。
[0018] 在一个实施方案中，本发明方法是这样的，即步骤（b)包括至少一个洗涤步骤，用 于在从配体洗脱TgFVII或TgFVIIa之前除去未结合的材料，并且进一步任选地包括用于除 去结合在树脂上且具有比TgFVII或TgFVIIa更弱亲和力的污染物的第二洗涤步骤。
[0019] 在本发明的一个实施方案中，用于纯化TgFVII或TgFVIIa的源生物材料获自生产 TgFVII和/或TgFVIIa的转基因动物。优选地，所述动物是雌性哺乳动物，并优选雌兔，以 及源生物材料是乳。
[0020] 在一个实施方案中，本发明的方法还包括在步骤（a)之前的收集并澄清乳的预备 步骤。优选地，通过加入柠檬酸盐，然后过滤来执行乳澄清步骤。
[0021] 在一个实施方案中，本发明的方法还包括在其中TgFVII和/或TgFVIIa被保留在 离子交换剂上的条件下，在离子交换剂上，并优选在阴离子交换剂上，对洗脱的TgFVII和/ 或TgFVIIa的色谱纯化的步骤c)。
[0022] 在一个实施方案中，本发明的方法还包括在其中TgFVII和/或TgFVIIa被保留 在伪亲和树脂上的条件下，在伪亲和树脂，并优选在羟磷灰石上，对洗脱的TgFVII和/或 TgFVIIa的色谱分离的步骤d)。
[0023] 在一个实施方案中，本发明的方法还包括在尺寸排阻支持物上对洗脱的TgFVII 和/或TgFVIIa的色谱分离的步骤e)。这一步骤优选地致力于TgFVII和/或TgFVIIa抛 光和配制。
[0024] 在一个实施方案中，本发明的方法还包括消除和/或灭活病毒的至少一个步骤， 优选通过纳米过滤和/或通过溶剂/去污剂处理。
[0025] 在一个实施方案中，本发明的方法还包括配制、杀菌和冷冻干燥经纯化的TgFVII 和/或TgFVIIa的最终步骤。
[0026] 在一个实施方案中，在亲和色谱步骤期间，本发明的方法还包括步骤：
[0027] (a)在使所述配体结合TgFVII和/或TgFVIIa的条件下，用来自含有重组产生的 TgFVII和/或TgFVIIa的转基因雌兔的乳装载已经固定有如上所定义的配体的色谱树脂；
[0028] (bl)洗涤未结合的材料；
[0029] (b2)洗涤具有对配体的亲和力比TgFVII和/或TgFVIIa更弱的污染物；和
[0030] (B3)从树脂洗脱 TgFVII 和 / 或 FVIIa。
[0031] 在一个实施方案中，在本发明方法的亲和色谱步骤期间，所述用于除去弱结合的 材料的第二洗涤步骤是由包含10%至50%的疏水剂的缓冲液执行，并且其离子强度是从 200至600mM的范围。
[0032] 在一个实施方案中，在本发明方法的亲和色谱步骤期间，所述用于从树脂洗脱 TgFVII和/或TgFVIIa的洗脱步骤是由包含20%到70%的疏水剂的缓冲液执行，并且其离 子强度是从500至2500mM的范围。
[0033] 参考以下列出的附图，本发明的其它特征和优点将从作为非限制性实例给出的本 发明实施方案的以下描述中显而易见。
[0034] 附图的简要说明
[0035] 图1展示具有重多肽链而缺少轻链的骆驼科免疫球蛋白的IgGl、IgG2和IgG3形 式的图示。
[0036] 图2展示在本发明工艺期间的RMP清除的图示。RMP水平以ppm指示作为该工艺 的步骤的函数。
[0037] 图3展示在本发明工艺期间的DNA清除的图示。DNA水平以ppb指示作为该工艺 的步骤的函数。
[0038] 图4展示通过纯化工艺的TgFVII活化。泳道1-9分别对应于：泳道1和9 :分子 量，泳道2 :澄清乳，泳道3 :FVII-选择的洗脱液（在本发明的配体亲和色谱之后），泳道4 : 中间产物1 (在超滤后和渗滤后），泳道5 :纳米过滤，泳道6 :QSXL洗脱液，泳道7 :CHT-I洗 脱液，泳道8 : SEC池。
[0039] 图5展示了在预过滤和溶剂/去污剂处理（样品命名为初始加载）的步骤后，以 及在亲和FVII选择色谱（样品命名为洗脱液A)洗脱后，在样品中的病毒负载的直方图。
[0040] 发明详细说明
[0041] 转基因因子VII或因子Vila
[0042] 本发明纯化方法特别地是依赖于使用对转基因因子VII (TgFVII)和/或转基因活 化因子VII (TgFVIIa)表现出特异性亲和力的配体。
[0043] 用于本发明中的转基因因子VII和因子Vila的氨基酸序列是已知的。特别地，转 基因因子VII的氨基酸序列与人因子VII的氨基酸序列（如在美国专利号4, 784, 950中公 开）相同。
[0044] 源生物材料
[0045]本发明的方法尤其用于纯化从各种生物来源获得的转基因FVII和/或FVIIa，它 们在此被称为"源生物材料"。
[0046] 在本发明的一个实施方案中，源生物材料含有转基因FVII和/或FVIIa并且获自 已被修饰来产生转基因FVII和/或FVIIa的转基因动物（或者是已被修饰的动物的后代） 的体液的分级。转基因动物优选哺乳动物，例如牛、兔、山羊、绵羊等。优选地，含有TgFVII 和/或TgFVIIa的源生物材料是哺乳动物乳的样品，即在其乳中生产转基因FVII和/或 FVIIa的转基因哺乳动物乳的样品。
[0047] 用于在转基因动物的乳中生产转基因FVII蛋白质的方法可以包括以下步骤：将 包含编码转基因FVII (其氨基酸序列对应于人FVII)的基因的合成的DNA分子转移到非人 哺乳动物胚胎中，该基因是由乳中天然分泌的蛋白质的启动子控制的。随后将胚胎引入相 同物种的雌性哺乳动物中，该雌性哺乳动物然后生出转基因动物。一旦对象充分发育，诱导 哺乳动物泌乳并收集乳。乳将含有所需的重组蛋白。EP 0 527 063提供了在除了人类以 外的其他雌性哺乳动物的乳中制备转基因FVII (TgFVII)的工艺的一个实例。在这个具体 实施方案中，通过引入含有用于WAP基因的启动子的序列构建了含有WAP启动子的质粒，并 且这