一种针对vsg的伊氏锥虫纳米抗体及其编码序列与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术或生物医学领域，涉及一种针对于伊氏锥虫变异表面糖蛋白(variant surface glucoprotein, VSG)的纳米抗体，其编码序列及应用。
【背景技术】
[0002]伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)病是由伊氏锥虫引起的一种血液原虫病，在世界范围内广泛分布，我国许多地区都有分布。伊氏锥虫主要寄生于马、驴、骡、水牛、黄牛、奶牛、绵羊等家畜，一些野生动物如虎、鹿和骆驼也常见感染。伊氏锥虫病能直接引起动物的急性死亡或隐性感染，造成贫血，死胎、流产，泌乳减少等，给我国畜牧业造成极大的损失。另外，国外还有感染人的报道，因此伊氏锥虫病也是一种人畜共患寄生虫病。该病的控制有赖于有效的检测诊断方法。
[0003]目前伊氏锥虫病的检测和诊断方法主要有:
(1)病原学方法，如镜检法；
(2)分子生物学检测方法，如聚合酶链反应(PCR)法、环介导等温扩增 (lamp)法。
[0004](3)免疫学检测方法，如补体结合试验、间接血凝试验、胶乳凝集试验、酶联免疫吸附测定法、间接荧光抗体试验等等。目前应用的最多的仍然是免疫学检测方法，而免疫学方法检测的关键就是筛选出活性高的特异性抗体。
[0005]纳米抗体技术，是在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术研发得到，是目前已知最小的可结合抗原的抗体分子。最初有比利时科学家Hamers.R在骆蛇血液中发现，普通的抗体蛋白由两条重链和两条轻链组成，而从骆驼血液中发现的新型抗体只有两条重链，没有轻链，这些新型抗体能像正常抗体一样于抗原紧密结合，但不像单链抗体那样相互粘连聚集成块。以其为基础构建的纳米抗体不仅分子量为普通抗体的1/10，而且化学性质也更加灵活，稳定性好，可溶性高，表达容易且容易获得，并能够偶联其他分子，因此应用纳米抗体技术研发锥虫检测试剂具有广阔的应用前景。本发明正是利用该技术，利用筛选得到的伊氏锥虫变异表面糖蛋白抗原特异的纳米抗体，用于检测锥虫感染。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种针对伊氏锥虫变异表面糖蛋白(VSG)的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在制备检测的应用。
[0007]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:一种针对VSG的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区⑶R，所述框架区FR包括FRl?FR4的氨基酸序列:其中，FRl的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述互补决定区⑶R包括⑶Rl?⑶R3的氨基酸序列:⑶Rl的氨基酸序列SEQ ID NO:2所示，⑶R2的氨基酸序列SEQ ID NO:4所示，CDR3的氨基酸序列SEQ ID NO:6所示。
[0008]进一步的，所述的VSG纳米抗体的VHH链，它具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
[0009]一种VSG纳米抗体，它针对VSG表位的纳米抗体，包括两条具有SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的VHH链。
[0010]一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质:上述的针对VSG纳米抗体的VHH链，或上述的VSG纳米抗体。
[0011]—种表达载体，它含有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
[0012]一种宿主细胞，它可以表达VSG纳米抗体。
[0013]一种VSG纳米抗体在制备VSG检测试剂方面的应用。
[0014]有益效果:与现有技术相比，本发明的优点如下:本发明首先制备及纯化伊氏锥虫变异表面糖蛋白，将其免疫骆驼，制备VSG特异的纳米抗体库，然后将纯化后的VSG偶联在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选高表达的VSG特异的纳米抗体，并将其转入大肠杆菌TG1，建立能在大肠杆菌TGl中高效表达的纳米抗体株。
【附图说明】
[0015]图1是VSG纳米抗体的DNA电泳图，M分子量marker，I阴性对照，2_19 PCR产物，条带约600bp。
[0016]图2是VSG纳米抗体经镍柱亲和层析纯化后再经AKTAexpress纯化后的SDS-PAGE电泳图和Western blot印迹图；其中M为分子量标记，单位kD，1-5表示VSG纳米抗体；
图3是应用VSG纳米抗体识别伊氏锥虫VSG的酶联免疫吸附试验(ELISA)结果。图中“▲ ”曲线为VSG纳米抗体，“ ■”曲线为阴性对照抗体SEA。
【具体实施方式】
[0017]以下实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
本发明应用针对VSG纳米抗体偶联在酶标板上，展示蛋白质的正确空间构象，以此形式的抗原筛选免疫纳米抗体库(骆驼重链抗体噬菌体展示库)，而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
[0018]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0019]实施例1
本实施例构建伊氏锥虫VSG特异纳米抗体库，步骤如下:
(1)首先纯化伊氏锥虫VSG抗原，然后将ImgVSG抗原与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只羊蛇(Alpa-Vet，www.alpa-vet.be)，每周一次，共免疫7次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体；
(2)7次免疫结束后，提取10ml羊驼外周血淋巴细胞并提取总RNA ；
(3)合成cDNA并利用套式PCR扩增VHH；
(4)利用限制性内切酶pstl及NotI酶切20ug噬菌体展示载体及1uIVHH并连接两个片段；
(5)将连接产物转化至电转感受态细胞TGl中，构建VSG纳米抗体文库并测定库容，库容大小为5.1XlO9O
[0020]实施例2
本实施例筛选VSG特异的纳米抗体，步骤如下:
(1)将溶解在10mMNaHCO3^ pH8.2的20ug VSG包被在NUNC酶标板上，4°C放置过夜；
(2)第二天加入10ul3%milk，室温封闭2h ；
(3)2h后，加入10ul 10ntfu含有VSG纳米抗体文库的辅助噬菌体，室温作用Ih;
(4)第一轮淘选用0.05%PBS+Tween-20洗10遍/第二轮20-25遍/第三轮20遍，除掉非特异性结合的噬菌体；
(5)用10mMTEA(triethylamine)将与VSG特异结合的■菌体解离下