一个牛α-actin基因的启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一个牛a-actin基因的启动子及其应用，属于遗传工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 真核生物的基因表达调控是一个复杂而严密的过程。在转基因动物的研宄中，获 得能广泛应用的高效特异性的启动子对于外源基因的表达具有十分重要的意义。启动子是 基因（gene)的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动子 (Promoters)就像"开关"，决定基因的活动。既然基因是成序列的核苷酸（nucleotides)， 那么启动子也应由DNA组成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录 (transcription)因子的这种蛋白质（proteins)结合而控制基因活动的。转录因子就像 一面"旗子"，指挥着酶（enzymes) (RNA聚合酶polymerases)的活动。这种酶制造着基因的 RNA复制本。一般分为广谱表达型启动子、组织特异性启动子、肿瘤特异性启动子等多种形 式。启动子区的基本结构：启动子是一段位于结构基因5'端上游区的DNA序列，能活化RNA 聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。因为基因的特异性转录 取决于酶与启动子能否有效地形成二元复合物，故RNA聚合酶如何有效地找到启动子并与 之相结合是转录起始过程中首先要解决的问题。有实验表明，对许多启动子来说，RNA聚合 酶与之相结合的速率至少比布朗运动中的随机碰撞高100倍。转录单元（transcription unit)是一段从启动子开始至终止子（terminator)结束的DNA序列，RNA聚合酶从转录起 点开始沿着模板前进，直到终止子为止，转录出一条RNA链。在细胞中，一个转录单元可以 是一个基因，也可以是几个基因。转录起点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上 的碱基，研宄证实通常为一个嘌呤。常把起点前面，即5'末端的序列称为上游（upstream)， 而把其后而即3'未端的序列称为下游（downstream)。在描述碱基的位置时，一般用数字 表示，起点为+1，下游方向依次为+2、+3……，上游方向依次为-1、-2、-3……。启动子的 特异性由多个元件控制，在不同种类和不同发育时期起关键作用的调控元件并不相同，调 控元件和反式作用因子之间的相互作用也十分复杂。因此要使外源基因能够在动物组织 中能够高效特异性地表达，启动子的选择是构建其表达载体的重要的条件之一。目前对于 转基因动物领域启动子活性的研宄通常采用启动子缺失片段活性分析法。即根据转录因 子预测软件分析和确定启动子缺失片段大小，采用PCR法获得不同大小的缺失片段。然后 通过pGL3-Basic构建启动子活性检测载体，通过双荧光素酶活性测定试剂盒检测启动子 缺失片段活性。如果启动子缺失片段之间出现特殊活性变化，可通过碱基突变实验进行验 证。赵丹丹（2009年）对牛a-actin启动子进行了缺失突变研宄，证明牛a-actin启动 子各缺失片段都具有很强的肌肉特异性，并且证明其中有一段转录活性相对较高，且长度 适中（262bp)。但是它的转录活性与一些强启动子相比仍然较低。如何寻找到一种能够提 升a -actin基因的表达活性且具有较强的肌肉特异性的启动子以应用于提高肌肉产量的 转基因肉牛生产成为急需解决的一大难题？所以，发明一个牛a-actin基因的启动子及 其应用，寻找到一个具有较强的启动活性和骨胳肌特异性并在牛骨胳肌卫星细胞中能够显 著提高a-actin基因表达活性的启动子是必要的。
【发明内容】
[0003]为了构建一种能够提升a-actin基因的表达活性且具有较强的肌肉特异性的 启动子，以应用于提高肌肉产量的转基因肉牛生产，本发明提供了一个牛a -actin基因 的启动子及其应用。该牛a-actin基因的启动子及其应用利用对牛a-actin启动子进 行了启动子[片段化研宄，方法同赵丹丹（2009年），构建一段转录活性相对较高且长度 适中（262bp)的牛a-actin启动子缺失片段，但是该片段的转录活性与一些强启动子相 比仍然较低。继续进行PCR定点突变研宄，发现牛a-actin基因262bp启动子片段内部 一段含有3个SRE正调控元件的170bp的核酸序列，将其使用不同引物进行PCR扩增，得 到2个170bp的核酸序列，将2个170bp的核酸序列串联于262bp启动子片段的上游，即 17(^?-17(^?-262&?，构建成一个新的€[-￡1(^111基因的启动子。最后，采用双荧光素酶报 告系统验证该启动子在牛骨胳肌卫星细胞和牛成纤维细胞中的活性，发现其在前者中的活 性甚至能够超过CMV病毒启动子，其在后者中的活性较低，从而证明了所得到的a -actin 基因的启动子具有较强的启动活性和骨胳肌特异性。同时，该启动子在牛骨胳肌卫星细胞 中能够显著提高a-actin基因的表达活性。因此，构建的新启动子可以作为高效特异性 的骨骼肌启动子应用于提高肌肉产量的转基因肉牛生产，从而达到通过构建一种能够提升 a-actin基因的表达活性且具有较强的肌肉特异性的启动子以应用于提高肌肉产量的转 基因肉牛生产的目的。
[0004]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0005] 一个牛a -actin基因的启动子及其应用的启动子片段的核酸序列为Seq ID No : 1，具体构建及验证过程如下：
[0006] 1.牛a -actin基因262启动子片段内部170bp①核酸片段的克隆：以本实验室 已经构建好的阳性重组质粒pGL3_a -actin262为模板，利用设计好的引物对牛a -actin 基因262启动子片段中转录位点上游-224bp至-55bp之间含有多个SRE调控元件的序 列进行PCR扩增，获得了170bp的核酸序列，并将此序列命名为：a-actinl70①。其中 a -actinl70①中含有KpnI、BamHI双酶切位点。
[0007] 2.牛a -actin基因262启动子片段内部170bp②核酸片段的克隆：以本实验室 已经构建好的阳性重组质粒pGL3_a -actin262为模板，利用设计好的引物对牛a -actin 基因262启动子片段中转录位点上游-224bp至-55bp之间含有多个SRE调控元件的序 列进行PCR扩增，获得了170bp的核酸序列，并将此序列命名为：a-actinl70②。其中 a -actinl70②中含有BamHI、XbaI双酶切位点。
[0008] 3.含有牛a-actinl70①与a-actinl70②的pMD18-T克隆载体构建。（克 隆获得的载体命名为pMD18-T-Double-a -actinl70-a -actin262):用BamHI、Xbal双 酶切PMD18-T- a -actinp262 (本实验室已构建）和pMD18-T- a -actinl70②，分别回 收PMD18-T- a -actinp262载体大片段和170bp的a -actinl70②片段，并将二者连 接，构建PMD18-T- a -actinl70 ②-a -actinp262重组质粒，BamHI、Xbal双酶切鉴定 阳性重组质粒。用Kpnl、BamHI双酶切pMD18-T- a -actinl70 ②-a -actinp262和 pMD18-T-a -actinl70①，分别回收pMD18-T-a -actinl70②-a -actinp262载体大片段和 170bp的a -actinl70①片段，并将二者连接，构建pMD18-T-Double-a -actinl70-a -acti n-262bp重组质粒，KpnI、BamHI双酶切鉴定阳性重组质粒。
[0009] 4.含有牛a-actinl70①与a-actinl70②的pGL3表达载体构建。（克隆获 得的载体命名为pGL3-Double-a -actinl70-a -actin262):