一种重组猪流行性腹泻病毒n蛋白及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组猪流行性腹泻病毒N蛋白及其制备 方法。
【背景技术】
[0002] 猪流行性腹泻（Porcineepidemicdiarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒 (Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)引起的一种以呕吐、腹泻、脱水为主要特征 的急性高度接触性肠道传染病，哺乳仔猪感染后具有高致死率和高感染率。各个年龄 段的猪均易感染，该病最初于1971年在比利时和英国发现，此后，许多国家陆续报道该 病的流行，在仔猪尤为严重，1976年我国首次报道该病；1955年，国际病毒分类委员会 (InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV)在第6 次报告中将猪流行性腹 泻病毒归为冠状病毒属。尽管我国部分猪场采取了PEDV的疫苗免疫措施，但我国自2010年 以来，全国大部分养猪地区再度暴发该病，造成极其严重的损失。近年，韩国也发生该病流 行，至2013年以来该病又在美国、日本等国家也相继发生，造成巨大的经济损失。总体上， 该病已遍布世界养猪地区，给全世界养猪业造成严重的经济损失。
[0003] 目前，对PEDV的诊断方法主要有临床诊断、免疫胶体金、ELISA、RT-PCR等诊断方 法。他们的准确度、稳定性都很好逐渐被人们所重视。ELISA即酶联免疫吸附试验，它是目 前应用比较多，发展比较快的一种抗体检测方法。此方法即可检测抗原，能够直接检测出 粪便中的抗原，也可以检测抗体，当猪场当中出现腹泻的症状时即可用于检测，可做到早诊 断，早治疗，被广泛的应用于临床检测。
[0004] 现有文献中制备的检测试剂盒，准确度不高，市售的试剂盒的准确度较高，如，R&B 公司的Porcine-PEDV试剂盒，但是售价高，使用成本高。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述问题，本发明提供了一种重组N蛋白及其制备方法。
[0006] 本发明提供了一种如SEQID NO:1所示的核苷酸序列。
[0007] 本发明重组载体，其特征在于：包含SEQID NO:1所示的核苷酸序列。其中，所述 的重组载体是重组pET28a质粒。
[0008] 本发明重组菌，它包含前述的重组载体。其中，所述的重组菌为重组大肠杆菌。
[0009] 本发明重组猪流行性腹泻病毒N蛋白，其特征在于：它由SEQID NO:1所示的核苷 酸序列编码。它的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
[0010] 本发明重组猪流行性腹泻病毒N蛋白的方法，包含如下步骤：
[0011] i、取前述的重组大肠杆菌组菌，接种到添加有终浓度为50yg/ml的卡拉霉素的 LB培养基上，37°C、220r/min摇床培养，至0D6J直达到0. 4~0. 6时，加入IPTG至终浓度 为0? 8~1. 2mmol/L，25~37°C诱导表达1~7h;
[0012] ii、离心，得菌体，裂解，取沉淀，分离纯化，即得。
[0013] 步骤i中，IPTG的终浓度为0. 8mmol/L;诱导表达的温度为37°C;诱导表达的时间 为4h。
[0014] 步骤ii中，所述分离纯化的方法是KC1染色切胶纯化法。
[0015] 本发明通过重组表达的方式，获得了一种新的猪流行性腹泻病毒重组N蛋白，以 其作为抗原的ELISA检测试剂盒可以准确检测猪流行性腹泻病毒，与市售的R&B公司的 Porcine-PEDV试剂盒的检测结果基本一致，可以用于替代市售的试剂盒使用，特异性强、灵 敏度高、简单、快速，本发明N-蛋白制备方法简单，成本低廉。
[0016] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内 容所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0017] 图1PEDVN基因的RT-PCR扩增。M:DL2000 ; 1 :阴性对照；2-3 :RT-PCR扩增产物N 基因；；
[0018] 图2重组质粒PGEM-T-N的双酶切鉴定。M:DNAMarkerIII;1_2 :质粒PCR;3 :阴 性对照；4-5:BamHI和Xhol双酶切产物；
[0019] 图3PEDVN基因核苷酸序列同源性比较；
[0020] 图4PEDVN基因氨基酸序列同源性比较；
[0021] 图5PEDVN基因进化树；
[0022] 图 6 重组质粒的质粒PCR。M:DNAMarkerIII;1_3 :质粒PCR;4 :对照；
[0023]图 7重组质粒pET-28a-N的双酶切鉴定。M:DNAMarkerIII;1_2:BamHI和Xhol 双酶切产物；
[0024] 图8重组蛋白不同诱导表达时间。M:蛋白Marker;1 :pET-28a-N诱导前对照；2 : 诱导后lh;3 :诱导后2h;4 :诱导后3h;5 :诱导后4h;6 :诱导后5h;7 :诱导后6h;8 :诱导后 7h;9 :pET-28a诱导后对照；
[0025] 图9重组蛋白不同诱导表达温度。M:蛋白Marker;1 :25°C诱导；2 :30°C诱导3 : 37°C诱导；
[0026] 图10重组蛋白不同诱导IPTG浓度。M:蛋白Marker;1 :pET-28a诱导后对照；2 : pET_28a_N诱导前；3 :0? 2mM;4 :0? 4mM;5 :0? 6mM;6 :0? 8 ;7 :1.OmM;8 :1. 2mM;
[0027] 图11重组蛋白可溶性分析。M:蛋白Marker;1 :pET-28a诱导后对照2 :总菌液； 3 :破菌后上清；4 :包涵体溶解液；
[0028] 图12重组蛋白的纯化结果。M:蛋白Marker;1_2 :纯化后蛋白；
[0029] 图13两种纯化方法对比。M:蛋白Marker;1:总菌液；2 :流传液；3 :破菌后上清 4 :KC1纯化；5 :亲和层析纯化；
[0030] 图14重组N蛋白免疫印迹分。M:蛋白Marker;1 :N蛋白。
【具体实施方式】
[0031] -、实验材料：
[0032] 1. 1菌株和质粒
[0033] 大肠杆菌DH5a和BL21(DE3) ;pET-28a(+)原核表达载体均由本实验室保存。
[0034] TGEV和PEDV二联苗、RV、PRSSV、APP、HPS阳性血清均是由本实验室保存。
[0035] 1. 2试剂
[0036] 反转录试剂盒、酵母提取物、胰蛋白胨、氨苄青酶素、卡那青霉素、总RNA提取试 剂盒（离心柱型）、50mg/mlIPTG(异丙基硫代-0 -D-半乳糖苷）、DAB、TMB、2xTaqPCR Mastermix、DNAMarkerIII、DL2000、预染MarkerIII购自北京天根生化科技有限公司。小 量质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自OMEGA公司；PrimeScriptRTreagentKit、BamHI、 Xhol均购自大连宝生物工程有限公司。PGEM-T载体、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、PEDV抗体 检测试剂盒购自成都飞克生物技术公司。
[0037] 1. 3设备
[0038] Sorvall ST 16R高速冷冻离心机，美国Thermo公司；MyCyclerTMPCR仪、琼脂糖水 平电泳槽、蛋白垂直电泳槽、凝胶成像系统、核酸蛋白仪，美国BI0-RAD公司。
[0039] 实施例1本发明重组猪流行性腹泻病毒N蛋白的制备
[0040] 一、实验方法
[0041] 1. 1N基因的克隆与生物信息分析
[0042] 1.1.1引物设计
[0043] 参照GenBank上已发表的PEDV N基因序列，设计了 一对特异性引物进行PCR扩增， 上游引物：5' -GGATCCATGGCTTCTGTCAGCTITCAG-3'下游引物：5' -CTCGAGTTAAITTCCTGTATCG AAGATC-3'上、下游引物的5'端分别引入BamH I和XhoI酶切位点，下划线为酶切位点， 引物由上海英骏公司合成。
[0044] 1. 1. 2 病毒RNA提取
[0045] 根据总RNA提取试剂盒的方法步骤提取总RNA。具体如下：
[0046] (1)提取250yL病毒悬液置于1. 5mL灭菌的离心管中，加入200yL氯仿于离心管 中，剧烈振荡15s，室温静置3min。4°C，12000r/min离心10min，小心把三层中的水相层吸 取到另一个新的1. 5mL离心管中。
[0047] (2)缓慢加入0. 5倍体积的无水乙醇，混匀。将溶液和沉淀一起加入到吸附柱CR3 中。4°C，12000r/min离心30s，弃掉收集管中的废液。
[0048] (3)力P500yL去蛋白液RD(事先已加入相应体积的乙醇）于吸附柱中，4°C， 12000r/min离心30s，尽量弃掉收集管中的废液。
[0049] (4)加700yL漂洗液RW(已加入相应体积的乙醇）于吸附柱CR3中，室温静置 2min，4°C，12000r/min离心30s，扔掉收集管中的废液。
[0050] (5)重复步骤（4)。将吸附柱放入1. 5mL收集管中，4°C，12000r/min空离2min，倒 掉残余液体。
[0051] (6)在超净工作台内通风5min，使乙醇充分挥发。
[0052] (7)将吸附柱转入一个新的1.5mL的离心管中，在吸附柱CR3中央加入30yL RNase-freeddH20,室温静置 2min，4°C，12000r/min离心 2min，弃掉吸附柱，置-20°C保存 备用。
[0053] 1 ? 1 ?3N基因的RT-PCR
[0054] 将提取的总RNA进行RT-PCR扩增，体系如下：
[0055] cDNA反应体系：
[0056]
【主权项】
1. 一种如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
2. -种重组载体，其特征在于：包含SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
3. 根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述的重组载体是重组pET28a质 粒。
4. 一种重组菌，其特征在于：它包含权利要求2或者3所述的重组载体。
5. 根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述的重组菌为重组大肠杆菌。
6. -种重组猪流行性腹泻病毒N蛋白，其特征在于：它由SEQ ID N0:1所示的核苷酸 序列编码。
7. 根据权利要求6所述的重组猪流行性腹泻病毒N蛋白，其特征在于：它的氨基酸序 列如SEQ ID NO : 2所示。
8. -种制备权利要求6或7所述重组猪流行性腹泻病毒N蛋白的方法，其特征在于： 包含如下步骤： i、 取权利要求5所述的重组大肠杆菌组菌，接种到添加有终浓度为50 μ g/ml的卡拉 霉素的LB培养基上，37°C、220r/min摇床培养，至OD6J直达到0. 4~0. 6时，加入IPTG至 终浓度为〇· 8~1. 2謹ol/L，25~37°C诱导表达1~7h ; ii、 离心，得菌体，裂解，取沉淀，分离纯化，即得。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤i中，IPTG的终浓度为0. 8mmol/L ; 诱导表达的温度为37°C ;诱导表达的时间为4h。
10. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤ii中，所述分离纯化的方法是KCl 染色切胶纯化法。
【专利摘要】本发明公开了一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，公开了包含该核苷酸序列的重组载体、重组菌，以及SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码的重组N蛋白及其制备方法。本发明重组猪流行性腹泻病毒N蛋白具有可以用于准确检测猪流行性腹泻病，检测的特异性强、灵敏度高、简单、快速等特点，可用于PEDV的血清学调查。
【IPC分类】C12R1-19, C12N15-70, C12N1-21, C12N15-50, C07K14-17
【公开号】CN104651379
【申请号】CN201510059962
【发明人】黄小波, 文心田, 段素芬, 曹三杰, 文翼平, 伍锐, 朱书权, 邓丽, 李亚青, 梁恩涛
【申请人】四川农业大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月5日