一种小鼠Loxl3基因条件性敲除的方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种小鼠Loxl3基因条件性敲除的方法与应用，属于基因工程技术领 域。
【背景技术】
[0002] 自从人类基因组计划完成以后，生命科学研宄进入了后基因组时代，而后基因组 时代的核心工作是研宄基因的功能。目前，研宄基因功能最有效的方法是基因打靶（基因 敲除和基因敲入）技术。基因打靶技术是近年来在生命科学研宄领域发展起来的一项新技 术，它是在胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES)技术和同源重组技术的基础上发展起来 的，可以定向操作和改变基因，然后通过观察和分析被改变基因动物的表型来获得基因功 能的信息。基因打靶技术还有另外一种重要用途一一制作人类疾病的动物模型。
[0003] 现有研宄显示，人类很多疾病是由于基因突变引起的，基因打靶技术可以精确操 纵动物染色体上的基因，从而制作出具有同人类疾病完全一样病症的动物模型，这对于查 清人类疾病的致病机理，特别是在寻找治疗人类疾病的特效药物方面有非常重要的实践意 义。
[0004] 美国北卡洛莱娜大学Oliver Smithies由于两项科学贡献而获得了2007年Nobel 生理学医学奖，一是把基因打靶所需的同源重组技术首先应用在哺乳动物细胞中，二是使 用基因打靶技术制作了一些人类疾病的动物模型。他在诺贝尔颁奖大会上演讲的题目就是 "让我们制作更多的人类疾病动物模型"。
[0005] 腭裂（CleftPalate，CP)是在新生儿中较为常见的先天性颅面部发育畸形，全 世界范围内新生儿发病率为1/700,而在我国新生儿中的发病率为1. 82%。，中国是目前世 界上唇腭裂患者数量最多的国家之一。腭裂的病因极其复杂，对腭裂的发病原因及其发 病机制仍不清楚。因而，目前迫切需要提供一种可用于腭裂发病机制研宄的小鼠模型。 L0XL3(lysyloxidase-1ike3)是赖氨酰氧化酶家族成员之一。赖氨酰氧化酶是一种细胞外 铜依赖氨基酸氧化酶。在人和多种动物中，赖氨酰氧化酶能将胶原和弹性蛋白中特定赖氨 酸的e-氨基氧化脱氨从而使二者交联，而这两者又是主要的细胞外基质结构蛋白。胶原 蛋白是参与腭的发育的重要蛋白，而且已有研宄表明抑制胶原的交联将导致腭裂的形成。 小鼠Loxl3基因定位在6号染色体上。目前，有关小鼠Loxl3基因的敲除还未见报道。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术的不足，提供一种小鼠Loxl3基因条件性敲除的方法与应 用。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[0008] 一种小鼠Loxl3基因条件性敲除的方法，出生后纯合敲除小鼠表现腭裂症状，包 括如下步骤：
[0009]构建Loxl3条件性基因敲除的重组载体，
[0010] 线性化重组载体并转染胚胎干细胞，
[0011] 筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆，
[0012] 将筛选出的发生同源重组的胚胎干细胞克隆显微注入C57BL/6供体小鼠的囊胚，
[0013] 将含有阳性胚胎干细胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宫，生产出嵌合体小鼠，
[0014] 嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠回交生出杂合子小鼠，
[0015] 将该杂合子小鼠与全身性表达Cre酶的Ella-Cre小鼠交配，获得双杂合的小鼠，
[0016] 雌性和雄性双杂合小鼠互交，从后代中获得具有腭裂表型的纯合基因敲除小鼠。
[0017] 根据本发明优选的，所述的构建LOX13条件性基因敲除的重组载体，步骤如下：
[0018] (1)提取含有loxl3基因的细菌人工染色体（BAC);
[0019] (2)PCR扩增六段同源重组片段，所述的引物序列分别为：
[0020] 同源重组片段A:F：GGACTAGTAGCAGCTTCAGCTTCAGACAC；
[0021] R：CGGGATCCTGGTCTCTGTCTCGGTGACTC；
[0022] 同源重组片段B:F：CGGGATCCGGGCCTTGAAAGTTCAGAGTT；
[0023]R：GCTCTAGACACTAGCACCACGTTCTACCC；
[0024] 同源重组片段C:F：ACGCGTCGACTCTAACTGCATGGGTCTTGCT；
[0025]R：GGAATTCCACCATAACCTTCCCTGGTTT；
[0026] 同源重组片段D:F：CGGGATCCTTTGCAAAGGGAAAGGAGAGT；
[0027]R：ATAAGAATGCGGCCGCCTAGTCCAGAGCATCGCTCAC；
[0028] 同源重组片段E:F：CCGCTCGAGCTGGACTAGCCCGGACATTAT；
[0029]R：GGAATTCCATTCGGATACCATTCACCTGC；
[0030]同源重组片段F:F：CGGGATCCACCAGCAAGCAGGAACTCAT；
[0031]R：ATAAGAATGCGGCCGCTGTTTGTTTCTGTGCCAAGC；
[0032] (3)分别将同源重组片段A和同源重组片段B连入质粒pL253,同源重组片段C和 同源重组片段D连入质粒pL452,同源重组片段E和同源重组片段F连入质粒pL451，分别 制得重组质粒PL253+A+B、重组质粒pL452+C+D、重组质粒pL451+E+F;
[0033] (4)将含有loxl3基因的BAC转化入EL350菌株，然后通过第一次同源重组，将质 粒PL253+A+B转化入含有BAC的EL350菌株，获得Retrieved质粒；再通过第二次同源重 组，将重组质粒PL452+C+D和Retrieved质粒共转化入EL350菌株，获得含有A+C+Neo+D+B 片段的二次同源重组质粒；利用Cre-loxP系统去除Neo序列，获得去掉Neo的二次同源重 组质粒；最后通过第三次同源重组，将重组质粒PL451+E+F和去掉Neo的二次同源重组质粒 共转化入EL350菌株，获得含有A+C+D+E+Neo+F+B片段的三次同源重组质粒，即为Lox13条 件性基因敲除的重组载体。
[0034] 根据本发明优选的，所述的胚胎干细胞为129/S6来源的胚胎干细胞。
[0035] 上述Loxl3基因条件性敲除的小鼠作为腭裂疾病发病研宄的模型鼠的用途。
[0036] 有益效果
[0037] 本发明首次获得了具有先天性腭裂症状的小鼠模型。先天性腭裂的发病机制复 杂，其发病机制目前尚未明确。制作稳定的腭裂动物模型对研宄人类腭裂的形成原因、演变 机制及预防具有重要意义。
【附图说明】
[0038]图 1、重组质粒pL253+A+B、pL452+C+D和pL451+E+F的构建模式图；
[0039]图2、Loxl3条件性基因敲除载体质粒构建模式图；
[0040] 图3、Loxl3纯合敲除小鼠表型为腭裂照片；
【具体实施方式】
[0041] 下面结合实施例及附图对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围 不限于此。
[0042]含有loxl3基因的BAC购自Source BioScience(名称：bMQ412ol7);
[0043]载体质粒pL253、pL452 和pL451 购自National Cancer Institute (NCI， http://ncifrederick. cancer. gov/research/brb/produc