一种mir-505双等位基因敲除的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因敲除领域，特别涉及一种rnir-505双等位基因敲除的方法。
【背景技术】
[0002] 1987年，日本课题组在E.coliK12的碱性磷酸酶基因附近发现串联间 隔重复序列[IshinoY,ShinagawaH,MakinoK,etal.Nucleotidesequenceof theiapgene,responsibleforalkalinephosphataseisozymeconversion inEscherichiacoli,andidentificationofthegeneproduce.JBacteri ol，1987, 169(12) :5429-5433]，在之后的研究中发现这类间隔重复序列广泛存在于细菌 和古生菌的基因组中，在2002年，被科学家正式命名为规律成簇间隔短小回文重复序列 (CRISPR)[JansenR,vanEmbdenJD,Gaastraff,etal.Identificationofanovel familyofsequencerepeatsamongprokaryotes.Omics:ajournalofIntearative Biology, 2002, 6 (1) : 23-33] ^[MojicaFJ,FerrerC,JuezG,etal.Longstretches ofshorttandemrepeatsarepresentinthelargestrepliconsofthearchaea HaloferaxmediterraneiandHaloferaxvolcaniiandcouldbeinvolvedinreplicon partitioning.MolMicrobiol, 1995, 17(1):85-93]^[JansenR,EmbdenJD,GaastraW,et al.IdentificationofgenesthatareassociatedwithDNArepeatsinprokaryotes. MolMicrobiol，2002, 43(6):1565-1575]。
[0003]CRISPR发现是一种细菌和古生菌的一种免疫系统，它是由一列短小的保守重 复序列被具有相似大小的独特的DNA序列所间隔，一种独特的DNA序列叫做间隔区，这 些间隔区通常来源于噬菌体或质粒DNA。CRISPR列和Cas(CRISPR-associated)基因形 成CRISPR-Cas适应免疫系统[Horvath，P.andBarrangou，R. (2010)CRISPR/Cas，the immunesystemofbacteriaandarchaea.Science327, 167 - 170]、[Barrangou，R.et al. (2007)CRISPRprovidesacquiredresistanceagainstvirusesinprokaryotes. Science315, 1709 - 1712]、[Gasiunas,G.etal. (2013)Molecularmechanismsof CRISPR-mediatedmicrobialimmunity.Cel1Mol.LifeSci.http://dx.doi.or g/10. 1007/s00018-013-1438-6]。CRISPR/Cas系统的功能是这样行使的：将入侵的核酸片 段作为间隔区合并入宿主基因组，随后将这些间隔区作为模板，产生小RNA分子（crRNA)， 这些crRNA能够和Cas蛋白结合成为效应复合物，它能够在下一轮的侵染中将外源核酸沉 默掉。
[0004]TypeII系统仅仅需要Cas9蛋白（以前称为Cas5或Csnl)就可以用于DNA干 扰[MojicaFJ，Diez-VillasenorC，Garcia-MartinezJ，etal.Interveningsequences ofregularlyspacedprokaryoticrepeatsderivefromforeigngeneticelements. JMolEvol，2005, 60 (2): 174-182]、[Sapranauskas，R.etal. (2011)TheStreptococcus thermophilusCRISPR/CassystemprovidesimmunityinEscherichiacoli.Nucleic AcidsRes. 39,9275 - 9282]^ [Deltcheva,E.etal. (2011)CRISPRRNAmaturation bytrans-encodedsmallRNAandhostfactorRnaseIII.Nature471，602 - 607]、 [Garneau,J.E.etal. (2010)TheCRISPR/Casbacterialimmunesystemcleaves bacteriophageandplasmidDNA.Nature468, 67 - 71]。TypeII系统进行革巴基因的双 链断裂的步骤：（i)pre-crRNA和tracrRNA从CRISPR位点被转录下来；（ii)tracrRNA和 pre-crRNA中的正向重复序列杂交形成双链，并与Cas9结合，pre-crRNA通过RNaseIII和 某未知核酸酶作用形成成熟的crRNA。该成熟的crRNA中包含有短的间隔序列；（iii)成 熟crRNA:tracrRNA杂交双链引导Cas9蛋白到祀DNA位点，DNA祀点需含有protospacer 和必需的PAM(protospaceradjacentmotif)，这一过程是通过crRNA的间隔序列于 protospacerDNA间形成杂化双链来完成；（iv)Cas9蛋白介导祀位DNA中PAM上游进行剪 切，在protospacer中进行双链断裂。
[0005] 2010年，VerduciL等发现miR-505能通过作用于其靶标ASF/SF2(可变剪接 因子）发挥调控小鼠胚胎成纤维细胞的增殖和衰老/凋亡的作用[Verduci，L，Simili M,RizzoM,MercatantiA,EvangelistaMetal. (2010)MicroRNA(miRNA)-mediated InteractionbetweenLeukemia/Lymphoma-relatedFactor(LRF)andAlternative splicingfactor/splicingfactor2(ASF/SF2)affectsmouseembryonicfibroblast senescenceandapoptosis.JBiolChem，285:39551_39563]，KarniR等发现在许多 细胞中转染ASF/SF2可以激活mTOR部分信号通路[KarniR，HippoY，LoweSW，Krainer AR(2008)Thesplicing-factoroncoproteinSF2/ASFactivatesmTORCl.ProcNatlAcad SciUSA105(40): 15323-15327]，但是ASF参与调控mTOR的具体方式还不清楚。Yamamoto Y等在研究肿瘤多药抗性时，发现miR-505是一个新的肿瘤抑制miRNA，与其呈现负相关的 蛋白Akt3,与mTOR通路上的AKT属于同一基因家族[YamamotoY，YoshiokaY，Minoura K，TakahashiR，TakeshitaFetal.，（2011)Anintegrativegenomicanalysisrevealed therelevanceofmicroRNAandgeneexpressionfordrug-resistanceinhuman breastcancercells.MolCancer，10:13539551-39563]。因此miR-505 极有可能通过调 控mTOR信号通路发挥其生物学功能，而mTOR通路是目前分子生物学研究的热点，它能整 合细胞内和细胞间的信号，起到调控细胞代谢，生长，增殖和存活等过程的中心调控者的作 用，mTOR通路的改变与多种疾病相关[MathieuLaplanteandDavidM.Sabatini，mTOR signalingataglance(2009)JCellSci122,3589-3594]。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种mir-505双等位基因敲除的方法，该方法 为构建基因彻底敲除细胞模型提供帮助，具有良好的应用前景。
[0007] 本发明的一种mir-SOS双等位