一种同时检测四种腹泻病毒的引物组及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于高分辨率熔解曲线分析技术（High ResolutionMeltingAnalysis,HRMA)的腹泻病毒快速检测试剂盒，及所述试剂盒中使用的 对于四种腹泻病毒（轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒）具有特异性的四对引物。
【背景技术】
[0002] 腹泻病（diarrheadiseases)是严重影响人类健康的一个重要公共卫生问题，在 发展中国家如亚、非、拉地区尤为严重。世界卫生组织（WHO)统计数据显示，全球5岁以下 婴幼儿，每年有10亿患腹泻，其中500万死亡。在中国，腹泻病是仅次于呼吸道疾病的第二 位多发病，也是婴幼儿死亡的两大病因之一。病毒性腹泻在腹泻中占有重要的比例，轮状 病毒（Rotavirus，RV)、星状病毒（Astrovirus，AV)、诺如病毒（Norovirus，NV)和扎如病毒 (Sap〇VirUS，SLV)等是主要的病原体。它们通过粪口途径在儿童和成人中引起急性胃肠炎 的散发和暴发，甚至大流行，如2008年初在英国出现的诺如病毒大暴发，每周约有10万人 感染该病毒，严重影响了人们的健康和社会的发展。因此，一套简便快速、特异性强的腹泻 病毒检测技术，可以为腹泻病的防控和临床诊断提供有力的技术支持。
[0003] 目前，针对腹泻病毒的检测，经典的方法有电镜观察、病毒分离培养、核酸杂交、酶 联免疫等。电镜观察不但敏感度低，而且价格昂贵，设备和技术条件要求甚高，无法应用于 临床常规检测和大规模的流行病学调查；病毒分离培养法的缺陷是操作繁琐，耗时很长，通 常需要一周左右的时间才能观察到细胞病理变化，不适于快速检测和临床紧急病情处理； 核酸杂交及酶联免疫检测因技术本身的限制，其灵敏度均比较低，漏检率高。较为现代的方 法包括普通核酸扩增技术（PCR)和实时荧光核酸扩增技术（RealtimePCR)等。PCR技术 是终点法分析，需要反复升降温的循环扩增和PCR后的凝胶电泳分析结果，耗时较长，容易 产生携带污染，使用的染料（EB等）具有致癌性，且其检测灵敏度仍有待提高。实时荧光核 酸扩增技术无需电泳分析，但是需要使用较为昂贵的特异性探针，成本较高，不利于大规模 使用。
[0004] 近年来，一种全新的高分辨率熔解曲线分析技术（HRMA)被开发出来。HRMA使用了 最新一代的饱和荧光染料，如LCGreenI或EvaGreen等，在常规PCR循环结束后设定温度 从65°C逐渐上升到95°C。在此过程中，扩增子逐渐解链，在到达熔解温度（Tm)时，DNA链 完全分开。在HRMA分析的初期，荧光强度很高，随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强 度也就下降了。荧光PCR仪记录下荧光变化的整个过程，通过对数据的作图，就生成了高分 辨率熔解曲线，其精度可达〇.ore。然后通过对这些曲线的分析实现高通量基因突变分析、 基因分型、单核苷酸多态性分析、病原体检测等。相对于传统的PCR技术或实时荧光PCR技 术而言，操作步骤大大简化，而且无需使用昂贵的探针，时间和成本也降低了不少，并且样 品经PCR扩增后直接进行HRMA分析，无需转移，真正实现了闭管操作，降低了污染的风险。
[0005] 目前针对腹泻病毒建立的HRMA分析技术极少，能搜索到的只有2篇报道，包括 EtsukoTajiri-Utagawa等人建立的用于检测诺如病毒的HRMA分析，以及AkihikoHata等 人建立的用于星状病毒检测的HRMA分析。但是尚无针对轮状病毒和札如病毒的HRMA分析 技术，更没有同时检测这四种病毒的HRMA技术开发的报道。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题，本发明提供了一批对四种腹泻病毒具有特异性检测作用的引 物；在此基础上，提供了一种基于HRMA技术，利用上述引物实现对四种腹泻病毒同时、快 速、高特异性、高灵敏性检测的试剂盒。
[0007] 本发明的技术方案为：
[0008] 一组基于高分辨率熔解曲线分析技术同时检测四种腹泻病毒的引物组，包括，
[0009] 用于检测轮状病毒的引物：
[0010]正向F1 :5' -GATACNTTRCCTGAYGGAGA-3'（SEQIDNO. 1)，
[0011]反向R1 :5' -CATCYTGAAAKATDGCATCACA-3'（SEQIDNO. 2);
[0012] 用于检测星状病毒的引物：
[0013]正向F2 :5' -AAAAYGTDCGAHTGAAGGA-3'（SEQIDNO. 3)，
[0014]反向R2 :5' -ABACAGTTCTYAACCAATG-3'（SEQIDNO. 4);
[0015] 用于检测诺如病毒的引物：
[0016]正向F3 :5' -AGRGTBGTCGTHTGGGACGA-3'（SEQIDNO. 5)，
[0017]反向R3 :5' -TGNGGGGTGTTNCCRTTCTT-3'（SEQ ID NO. 6);
[0018] 用于检测札如病毒的引物：
[0019]正向F4 :5' -ACTGTNMAYGGKTTCCATGT-3'（SEQIDNO. 7)，
[0020]反向R4:5'-CAGGRGANCGGTGTGTRCCAAT-3'（SEQIDNO.8);
[0021] 所述引物的病毒核酸变异位点使用简并碱基，R为A/G，K为G/T，M为A/C，W为A/ T，Y为C/T，S为C/G，V为A/C/G，B为C/G/T，H为A/T/C，D为A/G/T，N为A/G/T/C。
[0022] 本发明的内容还包括一组基于高分辨率熔解曲线分析技术同时检测四种腹泻病 毒的四联检测试剂盒，含有上述的引物组。
[0023] 进一步地，所述的四联检测试剂盒中包括2X扩增反应液、5X酶混合液、阳性对照 品、阴性对照品和空白对照品。
[0024] 进一步地，所述2X扩增反应液包括：Tris-HCl、KC1、MgC12、DTT、亚精胺、 Tween-20、牛血清白蛋白、dNTP、荧光染料、和权利要求1所述引物组。
[0025] 进一步地，所述焚光染料为EvaGreen。
[0026] 进一步地，所述5X酶混合液包括反转录酶、RNases抑制剂和HS-Taq酶。
[0027] 进一步地，所述阳性对照品分别为轮状病毒、星状病毒、诺如病毒和札如病毒体外 转录的RNA片段。
[0028] 进一步地，所述阴性对照品为无菌生理盐水。
[0029] 进一步地，所述空白对照为DEPC处理的无核酸酶的超纯水。
[0030] 本发明中一种基于HRMA技术的腹泻病毒检测用试剂盒所采用的技术方案是，所 述的四联检测试剂盒扩增反应液组分如下表1所示：
[0031] 表1 2X扩增反应液组分
[0032] CN104651538A 说明书 3/7 页
【主权项】
1. 一组基于高分辨率熔解曲线分析技术同时检测四种腹泻病毒的引物组，包括， 用于检测轮状病毒的引物： 正向 Fl :5' -GATACNTTRCCTGAYGGAGA-3'（SEQ ID NO. 1)， 反向 Rl :5' -CATCYTGAAAKATDGCATCACA-3'（SEQ ID NO. 2); 用于检测星状病毒的引物： 正向 F2 :5' -AAAAYGTDCGAHTGAAGGA-3'（SEQ ID NO. 3)， 反向 R2 :5' -ABACAGTTCTYAACCAATG-3'（SEQ ID NO. 4); 用于检测诺如病毒的引物： 正向 F3 :5' -AGRGTBGTCGTHTGGGACGA-3'（SEQ ID NO. 5)， 反向 R3 :5' -TGNGGGGTGTTNCCRTTCTT-3'（SEQ ID N0.6); 用于检测札如病毒的引物： 正向 F4 :5' -ACTGTNMAYGGKTTCCATGT-3'（SEQ ID NO. 7)， 反向 R4 :5' -CAGGRGANCGGTGTGTRCCAAT-3'（SEQ ID NO. 8); 所述引物的病毒核酸变异位点使用简并碱基，R为A/G，K为G/T，M为A/C，W为A/T，Y 为 C/T，S 为 C/G，V 为 A/C/G，B 为 C/G/T，H 为 A/T/C，D 为 A/G/T，N 为 A/G/T/C。
2. -组基于高分辨率熔解曲线分析技术同时检测四种腹泻病毒的四联检测试剂盒，含 有权利要求1所述的引物组。
3. 根据权利要求2所述的四联检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括2X扩增反 应液、5X酶混合液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
4. 根据权利要求3所述的四联检测试剂盒，其特征在于：所述2X扩增反应液包括： Tris-HCl、KCl、MgCl2、DTT、亚精胺、Tween-20、牛血清白蛋白、dNTP、荧光染料和权利要求1 所述引物组。
5. 根据权利要求4所述的四联检测试剂盒，其特征在于：所述荧光染料为EvaGreen。
6. 根据权利要求3所述的四联检测试剂盒，其特征在于：所述5X酶混合液包括反转录 酶、RNases抑制剂和HS-Taq酶。
7. 根据权利要求3所述的四联检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品分别为轮状 病毒、星状病毒、诺如病毒和札如病毒体外转录的RNA片段。
8. 根据权利要求3所述的四联检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照品为无菌生理 盐水。
9. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述空白对照为DEPC处理的无核酸酶 的超纯水。
【专利摘要】本发明公开了一组基于高分辨率熔解曲线分析技术同时检测四种腹泻病毒的引物组及含有上述引物的四联检测试剂盒，所述试剂盒可以特异性检测四种腹泻病毒：轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒。本发明通过对四种病毒基因组分别的同源性比对分析，寻找各自高度同源的保守序列设计引物，并利用高分辨率熔解曲线分析技术，同时检测四种腹泻病毒，具有简便快速、廉价、安全、灵敏度高、特异性强的特点，可以为腹泻病的防控和临床诊断提供有力的技术支持。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68, C12R1-93, C12Q1-70
【公开号】CN104651538
【申请号】CN201510106726
【发明人】汪海波, 谭华, 冯子力, 伍碧梅, 李艳兰, 赵俊华, 王琪, 莫秋华, 杨泽, 林继灿
【申请人】珠海国际旅行卫生保健中心
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月11日