测定实时pcr循环阈值的通用方法

测定实时pcr循环阈值的通用方法
【专利说明】测定实时PCR循环阈值的通用方法
[0001] 背景 本公开总体涉及用于处理代表S形或生长曲线的数据的系统和方法，并且更具体地 涉及用于确定实时聚合酶链式反应（PCR)扩增曲线中的特征性循环阈值（Ct)或弯头值 (elbow value)或其他生长曲线中的弯头值的系统和方法。
[0002] 聚合酶链式反应是用于酶促合成或扩增定义核酸序列的体外方法。所述反应通常 使用两个寡核苷酸引物，其与相反链杂交且侧接待扩增的模板或目标DNA序列。引物的延 伸由热稳定的DNA聚合酶催化。涉及模板变性、引物退火和由聚合酶延伸退火引物的重复 系列的循环导致特定DNA片断的指数累积。荧光探针或标记通常用于过程中，以便于扩增 过程的检测和定量。
[0003] 具体而言，同质（homogeneous)且在扩增开始或物理采样反应用于分析后不需要 添加试剂的荧光技术是有吸引力的。示例性同质技术使用定位目标区域的寡核苷酸引物和 用于生成信号的荧光标记或染料。典型的基于PCR的方法使用具有两个相互作用的发色团 的FRET寡核苷酸探针（相邻的杂交探针，TaqMan探针，分子信标，Scorpions)，只具有一 个焚光团的单一寡核苷酸探针（G-猝灭探针，Crockett, A. 0· *C.T.Wittwer，Anal. Biochem. 2001; 290:89-97 和 SimpleProbes, Idaho Technology)，和使用 dsDNA染料（例 如，SYBR Green I)取代共价的、荧光标记的寡核苷酸探针的技术。PCR中结合所有双链 (ds) DNA的DNA结合染料引起结合后染料的荧光。因此，PCR过程中DNA产物的增加因此导 致荧光强度的增加，并且在每个循环测量，从而允许DNA浓度得到定量。然而，一个潜在的 缺点是与所有dsDNA PCR产物的非特异性结合，这影响精确定量。关于标准稀释，PCR中的 dsDNA浓度可以得到测定。
[0004] 荧光报道探针只检测特异性探针结合的DNA序列，因此显著增加特异性。这允许 定量扩增物，甚至在非特异性DNA扩增存在的情况下。为了在相同反应中检测多个目标，荧 光探针可以用于多重测定中，其中具有不同颜色标记的特异性探针用于每个目标。荧光报 道探针的特异性还防止引物二聚体引起的测量干扰，所述引物二聚体是在扩增过程中不期 望的副产物。大多数应用基于荧光报道化合物和结合探针的荧光猝灭剂的相互作用。只要 报道分子和猝灭剂化合物密切靠近，则在用激发源（例如，激光，LED等）激发后只有基础 荧光可以检测到。一旦扩增发生，则报道分子和猝灭剂化合物的相互作用受到破坏，导致可 检测的荧光信号。在每个PCR循环扩增的产物的增加导致荧光的成比例增加，这是由于报 道分子和猝灭剂化合物的相互作用减弱。通常，在每个扩增循环中检测和测量荧光，并且其 对应于产物的指数增加的几何增加用于测定每个反应中的阈值循环（CT)。
[0005] 典型的动态PCR曲线显示于图IA中，其中绘制了典型PCR过程的荧光强度值相对 于循环数。在这种情况下，在PCR过程的每个循环中监测PCR产物的形成。扩增通常在热 循环仪中测量，其包括用于测量扩增反应过程中的荧光信号的组分和设备。此类热循环仪 的一个实例是Roche Diagnostics LightCycler (目录号20110468)。扩增产物，例如，借 助荧光标记的杂交探针（所述探针只有当结合目标核酸时才发射荧光信号）来检测，或者 在某些情况下还借助结合双链DNA的荧光染料来检测。
[0006] 对于典型的PCR曲线，鉴定在基线区域末端的转变点（其通常被称为弯头值或循 环阈值（Ct)值）对于理解PCR扩增过程的特征极为有用。Ct值可用作PCR过程的效率的 量度。例如，通常对于待分析的所有反应测定定义信号阈值，并且对于目标核酸以及对于参 考核酸诸如标准或持家基因测定达到该阈值所需的循环数（Ct)。目标分子（起始材料）的 绝对或相对拷贝数可以基于对于目标核酸和参考核酸获得的Ct值进行测定（Gibson等人， Genome Research 6:995-1001; Bieche 等人，Cancer Research 59:2759-2765，1999; TO 97/46707; WO 97/46712; WO 97/46714)。图IA中在基线区域15末端的弯头值20将 在循环数30的区域内。
[0007] RNA或DNA的量可以通过将结果与已知量的RNA或DNA的连续稀释物的实时PCR 产生的标准曲线进行比较来测定。聚合酶链式反应（PCR)扩增中目标分子的绝对或相对拷 贝数可以通过将循环阈值（Ct)值与标准曲线、与参考核酸的循环阈值（Ct)值或与绝对定 量的标准核酸进行比较来测定。此外，聚合酶链式反应（PCR)扩增的效率可以通过将待分 析的每个反应的循环阈值（Ct)与参考核酸的循环阈值（Ct)进行比较来测定。
[0008] PCR曲线中的弯头值可以使用几种现有方法来测定。例如，各种方法将弯头的实际 值（Ct)测定为其中归一化的PCR曲线上的荧光达到预定信号水平的值，被称为AFL(任意 荧光值），其可以对预弯头（pre-elbow) PCR循环中平均基线荧光水平的变化敏感。其他方 法使用其中荧光的二阶导数相对于循环数达到最大值的循环数，其可以给出晚期Ct值，特 别是对于抛物曲线。还有其他方法使用PCR曲线在拐点处的切线（最大一阶导数），当一阶 导数的最大值不存在时，这对于抛物曲线是有问题的。（Guescini, BMC Bioinformatics, 9:326，2008)。因此，后两种方法都具有抛物曲线的缺点。美国专利8, 219, 366通过鉴定 此类曲线和使用用于此类问题曲线的不同技术解决了抛物曲线的问题。尽管该方法对于定 性实时PCR运行良好，但当应用于定量实时PCR时，其在低拷贝数时可导致不精确的一些增 加。
[0009] 因此，期望提供用于测定生长曲线（诸如实时PCR扩增曲线或其他生长曲线）中 的Ct值的系统和方法，其克服了上述和其他问题。
[0010] 概述 提供了用于根据可适用于各种实验条件的一种技术来测定Ct的系统、方法和装置。 用于测定Ct的单一技术可用于标准S形生长曲线和用于有问题的生长曲线，诸如抛物曲 线。Ct值可以确定为二阶导数的最大值处相切于生长曲线的线与生长曲线的基线的交叉 点。此类Ct值可用于S形曲线和抛物曲线，并且可以提供线性校准曲线以实现测定初始浓 度中的精确度。
[0011] 例如，实施方案可以测定二阶导数最大值处双S形拟合（即，至PCR曲线的原始数 据点）的斜率和信号值。该斜率和信号值足以绘制与PCR曲线的基线相交的直线。该交叉 点然后可以定义为Ct值。
[0012] 根据一个实施方案，方法测定生长过程的生长曲线中的循环阈值Ct。接收代表生 长曲线的数据集。该数据集包括多个数据点。每个数据点具有一对坐标值：循环数和在所 述循环数处的生长过程的信号强度。计算近似数据集的函数。确定生长曲线的基线，其中所 述基线是线性的。计算机系统计算其中函数的二阶导数中的最大值出现的函数的第一点。 所述计算机系统确定在第一点相切于函数的切线。计算机系统计算切线与基线的交叉点， 其中所述交叉点的循环数是循环阈值ct。
[0013] 其他实施方案涉及与本文所述的方法相关的系统和计算机可读介质。
[0014] 本发明的性质和优点的更好的理解可以参考以下详述和附图获得。
[0015] 附图简述 图IA说明典型的PCR生长曲线的实例，其绘制为荧光强度相对于循环数。
[0016] 图IB是根据本发明的实施方案的模拟实时PCR曲线。
[0017] 图2A显示根据本发明的实施方案的PCR曲线110的一阶导数230的图200。
[0018] 图2B显示根据本发明的实施方案的PCR曲线110的二阶导数260的图250。
[0019] 图3显示图300,其具有模拟实时PCR曲线110,其说明根据本发明的实施方案测 定 Ct 375。
[0020] 图4是说明测定生长过程的生长曲线中循环阈值Ct的方法400的流程图。
[0021] 图5A显示由根据本发明的实施方案的PCR曲线110放大5倍的PCR曲线510的 图500。图5B显示由根据本发明的实施方