一种多肽菌素、其制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种多肤菌素、其制备方法及其应用。具体而言，本发明提供具有免疫 提高促进、细胞组织修复和/或抗菌促生长的作用的多肤菌素、其制备方法及其在制备抗 生素替代品或畜禽业的应用。
【背景技术】
[0002] 自Moore等（1946)首次报道，在饲料中添加抗生素能明显提高肉鸡的日增重W 来，人们对抗生素的研究和应用越来越广泛，先后有60余种抗生素应用于畜牧业，在动物 疾病防治、提高饲料利用率、促进畜禽生长等方面发挥了重要作用。但随着抗生素的大量使 化特别是不科学地滥化细菌耐药性和药物残留等问题日益突出，引起世界各国政府及业 内人±的高度重视。2006年，欧盟全面禁止了抗生素饲料添加剂的应用。我国是畜禽生产 大国，由于抗生素在我国养禽业的大量使用，特别是不科学地滥用，导致药物残留超标等问 题，出口量仅占生产量的0.9%~1.2%。
[0003] 养殖业中抗生素滥用的危害主要包括：
[0004] 1.导致细菌产生抗药性
[0005] 虽然耐药性因子的传递频率只有10-6,但由于细菌数量大、繁殖快，在该一频率 下，仍造成抗药菌株的扩散、蔓延，而且可W使一种细胞产生多种耐药性。抗生素滥用导致 耐药菌株增加，而抗生素饲料添加剂长期、大量不合理使用是其中一条主要原因。畜牧业 中，大肠杆菌、葡萄球菌、沙口氏菌等过去并不严重或较少发生的细菌病，现已上升为家禽 的主要传染病，该与长期滥用抗生素有直接关系。
[0006] 2.造成畜禽机体免疫力下降
[0007] 大量抗生素在其被摄入机体后，会随血液循环分布到淋己结、肾、肝、脾、胸腺、肺 和骨骼等各组织器官，动物机体的免疫能力就被逐渐削弱，人和动物慢性病例增多，一些可 W形成终生坚强免疫的疾病频频复发。抗生素还会导致抗原质量降低，直接影响免疫过程， 从而对疫苗的接种产生不良影响。
[0008] 3.引起畜禽内源性感染和二重感染
[0009] 抗生素虽都有自己的抗菌谱，但基本都难W避免在作用于病原菌同时会影响机体 内有益菌群生长，尤其是长期、大量使用，会造成机体内菌群失调，微生态平衡破坏。潜伏在 体内的有害菌趁机大量繁殖，而引起内源感染。另外一种情况，抗生素会消灭体内敏感菌， 在体内一些微生物附着点上造成大量空位，为外界耐药病菌乘虚而入提供机会，从而造成 外源感染。二重感染也是由于施用大量抗生素杀灭某种细菌时，破坏微生态平衡，另外一种 或多种内源或外源病菌随即再次感染机体造成的。
[0010] 4.在畜产品和环境中造成残留
[0011] 抗生素被吸收到体内后，分布到几乎全身各器官，但大多数抗生素都难W透过机 体的几个"天然屏障"，如血脑屏障、血睾屏障等。抗生素在内脏器官尤其是肝脏内分布较 多，而在肌肉和脂肪中分布较少。抗生素的代谢途径多种多样，但大多数W肝脏代谢为主， 经胆汁、由粪便排出体外；也会通过泌乳和产蛋过程残留在乳和蛋中。一些性质稳定的抗生 素被排泄到环境中后仍能稳定存在很长一段时间，从而造成环境中的药物残留。该些残存 的药物，通过畜产品和环境慢慢蓄积于人体和其它植物体中，最终W各种途径汇集于人体， 导致人体产生大量耐药菌株，失去对某些疾病的抵抗力，或因大量蓄积而对机体产生毒害 作用。
[0012] 因此，在全球经济一体化的时代，要提高我国畜禽产品的国际竞争力，抗生素安全 问题及对策研究已成为畜牧工作者的研究方向，寻找无公害的抗生素替代品已成为畜牧工 作者迫在眉睫的课题。
【发明内容】
[0013] 本发明提供了一种可作为抗生素替代品的多肤（W下称为多肤菌素），其具有免 疫提高促进、细胞组织修复和/或抗菌促生长的作用。
[0014] 本发明提供的多肤菌素的氨基酸序列为；Gly-Ly s-Ser-Gln-Glu-Tyr-Leu-Gly。
[0015] 此外，本发明还提供了上述多肤的制备方法，其包括根据Fmoc-固相多肤合成法 合成粗品多肤，优选的是，所述方法还包括使用反相高效液相色谱对所述粗品多肤进行纯 化。
[0016] 具体而言，所述Fmoc-固相多肤合成法中，W二氯树脂（2-化lorotrit^ 化loride)为固相载体，HOBt (1-羟基-苯并-H氮哇）/TBTU (苯并H哇四甲基四氣测酸）/ DIEA (N，N'-二异丙基己胺））为催化剂，二甲基甲醜胺DMF为溶剂和清洗剂，H氣己酸 (TFA)/1，2-己二硫醇巧DTV&O为切割剂，进行所述粗品多肤的合成。
[0017] 其中在合成时，所述方法使用分别使用下述氨基酸进行合成：
[0018] Gly:Fmoc-Gly-〇H ；
[0019] Lys:Fmoc_Lys炬oc)-OH
[0020] Ser:Fmoc-Ser(tBu)-〇H
[0021] Gln:Fmoc_Gln (T;rt)-OH
[0022] Glu:Fmoc-Glu (01:Bu)-OH
[0023] Tyr:Fmoc-Tyr(Tbu)-〇H
[0024] Leu:Fmoc-Leu-〇H
[0025] 更具体而言，所述Fmoc-固相多肤合成的步骤包括：
[0026] a.用二甲基甲醜胺DMF浸泡所述二氯树脂W将其活化；
[0027] b.根据Fmoc-固相多肤合成法，W二氯树脂为固相载体，DIEA为催化剂，DMF为溶 剂，连接第一个氨基酸到树脂；
[002引 C.用脈巧脱去Fmoc-基团，使第一个氨基酸的氨基游离出来，恢复反应活性；
[0029] d.可选地对树脂进行巧H丽显色检测，W鉴别Fmoc-基团是否脱除W及氨基酸的 连接是否完全；
[0030] e.洗涂后用W H0BT\TBTU\DIEA为催化剂，DMF为溶剂及清洗剂，连接第二个氨基 酸；
[0031] f. W同样方法连接其他的氨基酸；可选的是连接完每个氨基酸后都进行巧H丽 显色检测，并且结果呈阴性时才可进行下步反应；
[0032] g.连接完所有氨基酸后洗涂，并用氮气将树脂吹干；
[0033] h.用切割试剂将肤从树脂上切割下来；
[0034] i.将切下的肤再在冷己離中沉淀、洗涂、离也；
[00巧]j.冻干机中冻干获得粗品。
[0036] 其中，纯化时所述反相高效液相色谱条件为：
[0037] 多肤菌素纯化条件为：W水-己膳为二元梯度洗脱流动相。流动相A为0. 1 % H氣己酸的水溶液，流动相B为0. 1 %H氣己酸的己膳溶液，色谱柱为C18反相色谱柱， 50*250mm，紫外检测波长215nm，流速lOml/min，进样量10ml ;
[00測洗脱梯度：
[0039]
【主权项】
1. 一种多肽菌素，其特征在于，所述肽的氨基酸序列为Gly-Lys-Ser-Gln-Glu-Tyr-Le U-Gly 0
2. 权利要求1所述的多肽菌素的制备方法，其特征在于，所述方法包括根据Fmoc-固相 多肽合成法合成粗品多肽，优选的是，所述方法还包括使用反相高效液相色谱对所述粗品 多肽进行纯化。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Fmoc-固相多肽合成法中，以二氯 树脂为固相载体，H0Bt(l-羟基-苯并-三氮唑）/TBTU(苯并三唑四甲基四氟硼酸）/ DIEA(N，Ν'-二异丙基乙胺））为催化剂，二甲基甲酰胺DMF为溶剂和清洗剂，三氟乙酸 (TFA)/1，2-乙二硫醇（EDT)/Η20为切割剂，进行所述粗品多肽的合成。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，在合成时，所述方法使用分别使用下述氨基 酸进行合成：Gly: Fmoc-Gly-OH Lys:Fmoc-Lys(Boc)-OH Ser:Fmoc-Ser(tBu)-OH Gln:Fmoc-Gln(Trt)-OH Glu:Fmoc-Glu(OtBu)-OH Tyr:Fmoc-Tyr(Tbu)-OH Leu:Fmoc-Leu-OH0
5. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Fmoc-固相多肽合成的步骤包括： a. 用二甲基甲酰胺（DMF)浸泡所述二氯树脂以将其活化； b. 根据Fmoc-固相多肽合成法，以二氯树脂为固相载体，DIEA为催化剂，DMF为溶剂， 连接第一个氨基酸到树脂； c. 用哌啶脱去Fmoc-基团，使第一个氨基酸的氨基游离出来，恢复反应活性； d. 可选地对树脂进行茚三酮显色检测，以鉴别Fmoc-基团是否脱除以及氨基酸的连接 是否完全； e. 洗涤后用以HOBT\TBTU\DIEA为催化剂，DMF为溶剂及清洗剂，连接第二个氨基酸； f. 以同样方法连接其他的氨基酸；可选的是连接完每个氨基酸后都进行茚三酮显色 检测，并且结果呈阴性时才可进行下步反应； g. 连接完所有氨基酸后洗涤，并用氮气将树脂吹干； h. 用切割试剂将肽从树脂上切割下来； i. 将切下的肽再在冷乙醚中沉淀、洗涤、离心； j. 冻干机中冻干获得粗品。
6. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反相高效液相色谱条件为： 多肽菌素纯化条件为：以水-乙腈为二元梯度洗脱流动相。流动相A为0. 1 %三氟乙 酸的水溶液，流动相B为0. 1%三氟乙酸的乙腈溶液，色谱柱为C18反相色谱柱，50*250mm， 紫外检测波长215nm，流速10ml/min，进样量IOml ; 洗脱梯度： B : 5%-45% 30分钟（制备纯化） B:45%-90% 10分钟（柱冲洗） B :90% 10分钟（柱冲洗） B :5% 10分钟（柱平衡）。
7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述粗品多肽的纯度为85%以上，优选87% 以上，并且所述反相高效液相色谱纯化后的产品的纯度为98 %以上。
8. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述切割试剂的体积比为TFA :EDT =H2O = 95:2. 5:2. 5〇
9. 权利要求1所述的多肽菌素在制备用于免疫提高促进、细胞组织修复和/或抗菌促 生长的药物中的应用。
10. 权利要求1所述的多肽菌素在制备用于畜禽养殖的抗生素替代品中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种多肽菌素、其制备方法及其应用。本发明提供的多肽菌素，具有免疫提高促进、细胞组织修复和/或抗菌促生长的作用。本发明提供的化学合成法简便易行，能够满足畜禽业和市场的需要。同时满足了大规模工业化生产的需要。
【IPC分类】A61K38-08, A23K1-17, C07K1-20, A61P37-04, A61P31-14, C07K7-06, C07K1-06, A61P31-04, C07K1-04
【公开号】CN104672302
【申请号】CN201410794864
【发明人】吕志成, 杨赛, 鲍隆
【申请人】山东深海生物科技股份有限公司
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2014年12月18日