一种从人血浆中分离纯化人抗凝血酶-Ⅲ的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生物制药领域；涉及一种从人去冷沉淀血浆中分离纯化人抗凝血酶-III 的方法。
【背景技术】
[0002] 人抗凝血酶-III (Antit虹ombin- III，简称AT- III)为单肤链a糖蛋白，分子量约 58kD (千道尔顿），由423个氨基酸组成，是一种多功能丝氨酸蛋白酶抑制剂，在人体血浆中 的抗凝作用占整个抗凝作用的70%左右，其半衰期为2. 69天，患病时半衰期缩短，其主要 在肝脏合成，故在各种肝脏疾病发生时AT-III有不同程度的获得性缺乏。AT-III制品主要用 来治疗先天性遗传性抗凝血酶-III缺乏，AT- III缺乏症为常染色体显性遗传，据统计，该症 在欧美的发生率为0. 2%~0. 5%。AT-III制品还用来治疗获得性抗凝血酶III缺乏，见于各 种肝病，如肝硬化、重症巧、肝癌晚期等，W及各种病因引起的DIC综合症，产科与外科手术 等造成的血栓等。
[0003] 上世纪60~70年代即开始有人报道纯化AT-III的工艺，但是仅限于实验室开发。 1972年化imburger et al首次分离并鉴定4!'-111为32单链糖蛋白，但是其回收率较低， 大约在2%左右。1974年Maggie Miller-Andersson et al使用肝素亲和胶从血浆中纯化 AT-^I，然后经过DEAE-S巧hadexandSe地adexG200层析处理，其活性回收率为34%，纯 度在90% W上。1979年，Wicker et al首先叙述了工业规模制备临床用途的AT-III浓缩 物，其原料为工业生产丢弃的Cohn组分IV-1沉淀。1989年，化ffman等报道了大量制备 AT-III的方法，原料为Cohn氏工艺组分IV-1，通过肝素亲和层析与其它蛋白分离，之后，在 0. 5M构橡酸轴溶液中将AT- III浓缩物于6(TC加热10小时，W灭活己肝病毒和其他传染性 病毒，W后，再进行二次肝素亲和层析，成品比活不低于6. 4IU/mg，纯度大于95%,冻干 后4°C存放2年，仍有90% W上的生物学活性。1994年，W ytold等发表了 W重溶后Cohn 氏组分IV-1沉淀为原料，进行人血浆AT-III肝素亲和层析的大规模提纯改良法，该工艺包 括了病毒灭活的加热过程和为进一步提纯目的的第二步肝素亲和层析，上述方法可在5小 时内在40升柱上通过1800升的原液。AT- III成品纯度达95% W上，其平均效率为69%， 比活性为7. 7IU/mg蛋白，由20kg FIV-1沉淀获得30g AT- III，效果达15~20 %。90年 代W后，国外血液制品企业开始推出新的血浆分离纯化工艺，层析技术被广泛应用，直接W 去冷沉淀血浆为原料进行亲和层析制备AT- III的技术得到应用和推广，如法国的raL公司 等都采用此工艺进行制备AT-III制品。另外，为了去除难W采用S/D、加热等方法灭活的人 细小病毒炬19)，国际上相关制品都加W纳米膜过滤步骤来去除，本步骤采用过滤的方式将 制品溶液中可能含有的包括细小病毒B19在内的病毒去除掉，去除能力达到4个Log W上， 提高了制品的病毒安全性。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明提供了一种新的制备人免疫球蛋白的方法。
[0005] 本发明从人去冷沉淀血浆中分离纯化人抗凝血酶-III的方法，步骤如下：
[0006] (1)去冷沉淀人血浆层析
[0007] 先将人去冷沉淀血浆用0. 45 y m膜预过滤，然后粟入第一根肝素亲和层析柱中进 行第一次亲和层析，经过平衡、上样、洗涂、洗脱等步骤得到AT- III浓缩液，而流穿的血浆将 继续用于生产其他制品；其中层析温度范围为4C~15C，各步骤液体流速为每小时6~9 个柱体积；
[0008] ①平衡；用平衡液对亲和胶进行平衡，平衡液体积不少于4个柱体积；
[0009] ②上样；将预处理的人去冷沉淀血浆粟入层析柱中，通过亲和胶进行吸附；
[0010] ③洗涂；用洗涂液对亲和胶进行洗涂，洗涂液体积不少于8个柱体积，观察在线紫 外吸收图谱，至图谱趋于水平时停止洗涂；
[0011] ④洗脱：对亲和胶进行洗脱，观察在线紫外吸收图谱，并用洁净的容器收集吸收峰 处的流出液，即为AT- III浓缩液；
[0012] (2)S/D病毒灭活
[0013] 对步骤（1)中所得AT-III浓缩液用lOkD孔径超滤膜超滤除盐，将盐浓度降至 0. 15M~0. 25M，体积不变；按步骤（1)最终所得液体体积的10%，加入11% S/D病毒灭活 液，在24~25C揽拌6小时；
[0014] 11 % S/D病毒灭活液含吐温-80和磯酸H下醋（TNB巧，按每llOg吐温-80和33g TNBP加水至1千克的方法配制；
[0015] (3)第二次亲和层析
[0016] 对经S/D灭活后的溶液，过0. 45 y m膜预过滤，然后粟入第二根肝素亲和层析柱中 进行第二次亲和层析，经过平衡、上样、洗涂、洗脱等步骤得到AT-III原液，其中层析温度范 围为4~25C，各步骤液体流速为每小时6~9个柱体积；
[0017] ①平衡；用平衡液对亲和胶进行平衡，平衡液体积不少于4个柱体积；
[0018] ②上样；将步骤（2) S/D病毒灭活最终所得液体粟入层析柱中，通过亲和胶进行吸 附；
[0019] ③洗涂；用洗涂液对亲和胶进行洗涂，洗涂液体积不少于8个柱体积，观察在线紫 外吸收图谱，至图谱趋于水平时停止洗涂；
[0020] ④洗脱：对亲和胶进行洗脱，观察在线紫外吸收图谱，并用洁净的容器收集吸收峰 处的流出液，即为AT- III原液；
[0021] (4)超滤
[0022] 对步骤（3)中所得AT- III原液用lOkD孔径超滤膜超滤，将盐浓度降至0. 11M~ 0. 22M，并适当浓缩使每毫升溶液中的活性单位大于50IU，添加冻干保护剂，所述保护剂是 指甘氨酸，其最终浓度为0. 6%~1. 6% ;
[0023] 妨除菌过滤；
[0024] 化)20N纳滤膜过滤去除病毒；
[002引 （7)分装；
[0026] 做冻干：
[0027] ①分装后的制品常温入柜；
[0028] ②将隔板温度在40分钟内快速降至-4(TC，保持3小时；
[0029] ③开启真空粟，真空度控制在7Pa~15化；
[0030] ④2小时后将隔板温度升至-3(TC，保持3小时；
[0031] ⑥4小时后隔板温度升至-2(TC，保持6小时；
[0032] ⑧8小时后将隔板温度升至0°C，保持20小时；
[003引⑦10小时后将温度升至3(TC，保持6小时；真空度控制在5Pa W下保持1小时； [0034] ⑨真空压塞出柜；
[00对 （9)干热病毒灭活，干热温度100°C，时间为30min~60min ;
[003引步骤（1)和步骤（3)中：
[0037] 平衡液含氯化轴和巧樣酸轴，其中氯化轴浓度为0. 09M~0. 15M，巧樣酸轴浓度为 0. 015M~0. 025M，抑为6. 5~7. 5,其余为水；洗涂液中含氯化轴和巧樣酸轴，其中氯化轴 浓度为0. 3M~0. 5M，巧樣酸轴浓度为0. 015M~0. 025M，pH为6. 5~7. 5 ;其余为水；
[0038] 洗脱液中含氯化轴和巧樣酸轴，其中氯化轴浓度为2M~3M，巧樣酸轴浓度为 0. 015M~0. 025M，抑为6. 5~7. 5 ;其余为水；
[0039] W上百分比浓度除特别说明外均为质量百分比W上需要调节抑的地方，所用酸 碱均为0. 1M盐酸和0. 2M氨氧化轴。
[0040] 本发明的有益效果，本发明的工艺步骤操作简单，经两步亲和层析步骤，直接将去 冷沉淀血浆纯化得到高纯的AT-III浓缩物，加W两步必要的病毒灭活/去除步骤，进一步 提高了制品的病毒安全性。其工艺步骤操作简单，且制备过程中不会影响血浆用来生产下 游产品，最终所得制品安全可靠。本发明所得制品主要用来治疗各种原因引起的抗凝血 酶-III缺乏患者。
[0041] 综上，本发明方法制得的AT-III制品质量稳定可靠，安全，同时，本发明方法的收 率高达25 %，具有良好的市场应用前景。
[0042] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可W做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0043] W下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于W下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【具体实施方式】
[0044] 实施例1本发明从人去冷沉淀血浆中分离纯化人抗凝血酶-III的方法
[0045] 1、基本要求：
[0046] 在公司中试车间将所需设备调试好并标为备用状态；
[0047] 将所需容器管线及中试车间清洁干净并标为备用状态；
[0048] 准备好50化新鲜人去冷沉淀血浆，于0~4C融浆罐中保存备用。
[0049] 2、主要溶液配制方法
[0050] 抽提缓冲液中含氯化轴和巧樣酸轴，其中氯化轴浓度为0. 09~0. 15M，巧樣酸轴 浓度为0. 015M~0. 025M，抑为5