一种蛋白质的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域及医学免疫学领域，特别设及一种蛋白质。
【背景技术】
[000引人血清白蛋白化uman Serum A化umin，简称HSA)是人血中重要的蛋白质，其非糖 基化的单链多肤包含585个氨基酸，分子量为66kD。在血浆中其浓度为42g/l，约占血浆总 蛋白的60%。在体液中人血清白蛋白可W运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离 子和许多治疗分子等，同时维持血液正常的渗透压。在临床上人血清白蛋白可用于治疗休 克与烧伤，用于补充因手术、意外事故或大出血所致的血液丢失，也可W作为血浆增容剂。 同时临床上通过发现病人代谢白蛋白的异常，从而推测病人是否患有糖尿病、肾病、屯、脑血 管等慢性病。因此，能够提供一种可W高效、特异性结合HSA的蛋白质具有重要意义。
[0003] HSA具有很长的体内半衰期（两周左右），因此它也是人体血浆中主要的药物运 输蛋白，许多药物肤或蛋白在生物体内与人血清白蛋白结合能有效改善其代谢动力学特 性，延长半衰期，提高其稳定性和生理活性。国际申请WO 09/127691，名称为叩巧tides capable of binding to serum proteins and compounds, consteucts and polypeptides comprising the same(能够结合血清蛋白的肤和包含所述肤的化合物、构建体和多肤）"描 述了用于产生能够与血清白蛋白结合的肤、氨基酸序列，所结合的肤、氨基酸序列可W结合 或融合与治疗性结构部分、化合物、蛋白或其他治疗实体从而增加半衰期。
[0004] 目前市场中研制的能够与HSA结合的蛋白质品种少，亲和性不一致。因此筛选出 高特异性结合HSA的蛋白质具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种蛋白质。
[0006] 本发明的目的将通过W下技术方案得W实现；一种蛋白质，所述蛋白质的氨基酸 序列选自：
[0007] (a)如序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列；或者
[0008] 化）与序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的第52-56、71-87、120-132、 170-179、195-201、234-242位的核屯、序列至少有85%相似性的氨基酸序列。
[0009] 一种编码所述的蛋白质的核巧酸序列，所述核巧酸序列选自：
[0010] (a)如序列表中SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列；或者
[OCm] (b)与序列表中SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列的第154-168、211-261、358-396、 508-537、583-603、700-726位的核屯、序列至少有85%相似性的核巧酸序列。
[0012] 优选的，上述的一种蛋白质，其中，所述蛋白质与人血清白蛋白特异性结合。
[0013] 如本文所用，"相似性"是指核巧酸或氨基酸序列比对过程中用来描述检测序列和 目标序列之间相同DNA碱基或氨基酸残基顺序所占比例的高低，是一种直接的数量关系， 通过部分相同或相似的百分比来度量核巧酸序列或者氨基酸序列之间相似的程度，此相 似性百分比可W通过本领域已有的比对方法来计算，例子有两两序列间的比对方法FASTA 程序(Person, W. R. and Lipman, D. J. 1988. Improved tools for biological sequence comparison. Proc.P'Jatl. Acad. Sci. 85: 2444-2448)'BLAST 程序（Altschul,S.F.,et al.l990Basic local alignment search tool. J.Mol.Biol.215:403-410)等，或多序列 比对方法 CLUSTAL W(C0RPET,F.1998Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucleic Acids Res. ,16:10881-10890)等。
[0014] 本发明的突出效果是提供了一种CDR区不同的蛋白质，DM分子核巧酸序列如SEQ ID NO. 1 所示，其核屯、功能序列是第 154-168、211-261、358-396、508-537、583-603、700-726 位；蛋白质分子氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，其核屯、功能序列是第52-56、71-87、 120-132、170-179、195-201、234-242位。所述蛋白质与HSA可W特异性结合，与市场上的 HSA抗体相比亲和性有所提高，同时该蛋白质可W使用大肠杆菌进行可溶性高效表达，有望 在医学生物学领域和生物医药开发中有很好的应用。
[0015] W下便结合实施例附图，对本发明的【具体实施方式】作进一步的详述，W使本发明 技术方案更易于理解、掌握。
【附图说明】
[0016] 图1是本发明实施例lpBZl-1载体构建示意图；
[0017] 图2是本发明实施例2重组菌株诱导表达示意图；
[001引图3是本发明实施例3蛋白质纯化结果；
[0019] 图4是本发明实施例4蛋白质样本亲和力测定结果；
[0020] 图5是本发明实施例4市场上HSA抗体亲和力测定结果；
[002U 图6是本发明实施例5蛋白质肥STERN-BLOTTING结果；
[002引图7是本发明实施例6蛋白质肥STERN-BLOTTING结果。
【具体实施方式】
[0023] 下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。下述实 施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可 从商业途径获得。
[0024] 实施例1高特异性结合HSA分子表达载体的构建
[0025] 通过人工合成该分子的DNA序列，并在其编码序列的两端加入设计好的限制性酶 切位点，重组克隆至表达载体地Z007,序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示，序列上游加入 Ndel限制性酶切位点，序列下游加入化〇1限制性酶切位点，将上述序列通过基因合成的方 式连入地Z007表达载体，命名为地Z1-1，如图1所示，重组载体转化入宿主菌化21 0E3)。
[0026] 实施例化BZ1-1基因工程菌的诱导表达与鉴定
[0027] 将含有地Z1-1的化2UDE3)30°C震荡培养过夜，再按1%的接种量转接与氨节和 卡那双抗LB培养基中，待0D值为0. 6-0. 8时，加入终浓度为0. 6mM的IPTG诱导表达16h。 [002引取诱导表达后的菌体1ml，离屯、后按比例加入Loading buffer和PBS后，重悬菌 体，至沸水中煮5-lOmin，12000巧m离屯、5min后取10 y 1进行SDS-PAGE电泳，同时W不含 质粒的BL2UDE3)作为对照。12%分离胶，100V恒压，电泳化，电泳结束后，脱色至条带清 晰，根据电泳结果将有明显的目的蛋白表达带，结果如图2所示。
[0029] 实施例3重组蛋白的纯化
[0030] 诱导菌收集后破碎，用0. 22 ym滤膜过滤后，采用GE公司的AKTA plus蛋白纯化 系统层析纯化重组蛋白。SDS-PAGE检测结果表明呈单一目的带，无杂带，结果如图3所示。
[0031] 实施例4重组蛋白与HSA亲和力的鉴定
[0032] 偶联；纯化的重组蛋白经过biocore试验测定与HSA的亲和力，根据HSA的等电点 特性W及按照BiacoreX lOOcontrol soft的protocol优化偶联条件，选择抑4. 5醋酸钢 作为偶联稀释缓冲液，用此缓冲液稀释服A样品至25 y g/ml后偶联到CM5巧片上，偶联水 平 1500RU。
[003引邸测试；用抑7. 4的Running buffer稀释蛋白质样本，稀释一系列浓度至OnM、 50nM、100nM、200nM、400nM、800nM。设置结合时间为180s，解离时间lOmin，再生缓冲液用 50mMpHl. 7. Gly-HCl。按照 BiacoreX lOOcontrol soft 的 protocol 进行上机测试。
[0034] 数据处理；采用BiacoreXlOO自带分析软件进行分析。数据解读，蛋白质样本 KD为1.444E(-12)M，结果如图4所示；同时操作的目前市场上表现较好的服A抗体KD为 5. 090E(-10)M，结果如图5所示。
[0035] 结果显示，本发明中的蛋白质分子亲和力明显优于目前市场上表现较好的HSA抗 体。
[0036] 实施例5重组蛋白质的肥STERN-BLOTTING鉴定
[0037] 重组蛋白质经过SDS-PAGE，再用HRP标记的HSA检测，进行肥STERN-BLOTTING,结 果显示重组蛋白可W和HSA特异性结合，结果如图6所示。
[003引实施例6氨基酸序列的相似性
[0039] 序列表中 SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 分别是与 SEQ ID NO. 2 的第 52-56、71-87、120-132、170-179、195-201、2：M-242 位的核屯、序列具有 85 %、90 %、95 % 相 似性的氨基酸序列。SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5对应的重组蛋白的制备方法 与实施例1-3中SEQ ID NO. 2的重组蛋白的制备方法一致。
[0040] 同实施例 5, SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4 与 SEQ ID NO. 5 进行 肥STERN-BLOTTING,结果如图 7 所示，SEQ ID NO. 2 与 SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5的重组蛋白具有相同的生物活性，均与服A具有相似的高特异亲和性。
[0041] 本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方 案，均落在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列选自： (a) 如序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列；或者 (b) 与序列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的第52-56、71-87、120-132、170-179、 195-20U234-242位的核心序列至少有85%相似性的氨基酸序列。
2. -种编码权利要求1所述的蛋白质的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列选 自： (a) 如序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或者 (b) 与序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的第154-168、211-261、358-396、 508-537、583-603、700-726位的核心序列至少有85%相似性的核苷酸序列。
3. 根据权利要求1所述的一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质与人血清白蛋白特异 性结合。
【专利摘要】本发明揭示了一种蛋白质，其核苷酸序列和氨基酸序列。本发明所提出的蛋白质与人血清白蛋白(HSA)特异性结合，与市场上的HSA抗体相比亲和性有所提高，同时该蛋白质可以使用大肠杆菌进行可溶性高效表达，有望在医学生物学领域和生物医药开发中有很好的应用。
【IPC分类】C12N15-13, C07K16-18
【公开号】CN104672329
【申请号】CN201510084726
【发明人】杨艳坤, 杨冬, 张芃芃
【申请人】杨艳坤, 杨冬, 张芃芃
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月16日