用于生产β-丙氨酸的工程菌及生产β-丙氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物催化领域，尤其设及用于生产0-丙氨酸的基因工程菌的构建及 应用。
【背景技术】
[0002] 0-丙氨酸是自然界天然存在的唯一一个0型丙氨酸，在医疗，食品，化工领域有 广泛的应用。如作为化工原料合成泛酸巧、肌肤W及用于合成治疗肿瘤高血巧的帕米磯酸 钢和治疗溃瘍性肠炎的费特异性抗炎药物己柳氮。另外，0-丙氨酸还可W作为药剂制备 中的沉淀剂、水的净化絮凝剂、电锻缓蚀剂、铅中毒解毒剂W及用于合成甜味剂等。
[0003] 0 -丙氨酸化学法生产包括丙締膳法、丙締酸法、班巧酷亚胺降解法及0 -氨基丙 膳法。其中，丙締膳法是国内生产0-丙氨酸的主要方法。该方法将丙締膳和氨水氨化反 应生成0-氨基丙膳，再在酸性或碱性条件下水解即得。该方法原料易得，成本较低，但有 副反应，且水解过程中生成大量无机盐，产物较难纯化。
[0004] 近年来，通过生物转化法来生产0-丙氨酸因其反应条件温和、专一性强、环境 友好等特点受到越来越多的关注。生物转化法主要利用心天冬氨酸a駿化酶特异性地 脱去k天冬氨酸的a駿基，生成P -丙氨酸。1999年，Nicole等报道了在大肠杆菌中 过表达其自身来源的心天冬氨酸a駿化酶，酶活仅为〇.22U/mg，而在大肠杆菌中表达来 源于谷氨酸椿状杆菌的心天冬氨酸a駿化酶，酶活为3. 42U/mg(Nicole, 1999, Applied and Elnvironmental Microbiology)。2002 年，Qiopra 等发现来源于结核杆菌 (M. tuberculosis)的心天冬氨酸 a 駿化酶的酶活为 35 ]imol/g*h(Qiopra, 2002, Protein Expression and 化rification)〇2006年，中国专利申请公开No. CN 101210230A，其中公开 了使用过表达其自身来源的心天冬氨酸a駿化酶的大肠杆菌化21 〇)E3)进行生物催化， 最终产0-丙氨酸2. 94g/L。由此可见，该些早期研究中由于所选择的心天冬氨酸a駿化 酶活性较低，从而导致生物转化得到的0 -丙氨酸产量极低，无法达到工业化生产的需要。 因此，仍需要进一步开发可用于工业化微生物催化制备0-丙氨酸的工程菌及可行的制备 方法。
【发明内容】
[0005] 针对上述问题，本发明通过在大肠杆菌基因组上选择合适的整合位点，将本发明 人之前筛选到的高酶活的、来源于枯草芽抱杆菌炬acillus subtilis)的心天冬氨酸a 駿化酶编码基因整合到大肠杆菌基因组上，获得不包含质粒的基因工程菌，经发酵培养，不 仅能够表达产生高活性的心天冬氨酸a駿化酶，而且避免了菌体培养过程中抗生素的使 用及质粒丢失情况，适于工业化微生物酶催化制备0 -丙氨酸。
[0006] 为此，根据本发明，提供一种工程菌，其中所述工程菌是在大肠杆菌基因组上的一 个或多个位点（例如2~4个）整合有DNA序列的重组菌，所述DNA序列包含选自编码枯 草芽抱杆菌心天冬氨酸a駿化酶的基因和编码与所述酶具有至少60%、优选80%、更优 选90%、进一步优选95%和最优选98%、甚至99%同源性且具有所述酶活性的多肤的基因 中的一个。
[0007] 所述枯草芽抱杆菌k天冬氨酸a駿化酶优选为序列6所示的氨基酸序列。
[000引本发明的工程菌能够过表达序列6所示的枯草芽抱杆菌的k天冬氨酸a駿化 酶或者过表达与所述酶具有至少60 %、优选80 %、更优选90 %、进一步优选95 %和最优选 98%同源性且具有所述酶活性的多肤。
[0009] 根据一种实施方式，所述编码枯草芽抱杆菌心天冬氨酸a駿化酶的基因为序列 5所示的核巧酸序列。
[0010] 所述DNA序列进一步包含启动子序列。
[0011] 对所述启动子序列没有特别的限制，只要能够启动插入的心天冬氨酸a駿化酶 编码基因的任何启动子都是可行的。例如但不限于；枯草芽抱杆菌心天冬氨酸a駿化酶 基因自身的启动子，构建本发明工程菌所用质粒中携带的启动子，例如可W是PUC19中启 动子、祀T-30a(+)中的启动子，还可W是常用的强启动子，如Lac、T7等。优选T7启动子 (序列8)。
[0012] 根据一种实施方式，所述整合位点是大肠杆菌基因组中的化地基因和tlaB基因 中的位点。
[0013] 优选地，所述大肠杆菌为化21 0E3)。
[0014] 根据更为具体的实施方式，通过同源重组将由四个DNA片段组成的1 ? 2 ? 3 ? 4片 段整合到大肠杆菌化21 〇)E3)基因组中化地基因中，其中所述1 ? 2 ? 3 ? 4片段中，片段 1为大肠杆菌化21值E3)基因组（GenBank:AM946981. 2)第4287847-4287308位核巧酸的 DNA片段，片段2为质粒祀T30-panDe(序列7)第68-998位核巧酸的DNA片段，片段3为 质粒P邸4佑enBank:AY048743. 1)第31-1507位核巧酸的DNA片段，和片段4为大肠杆菌 BL21 〇)E3)基因组（GenBank:AM946981. 2)第 4287127-4286588 位核巧酸的 DNA 片段；
[0015] 丢掉kan抗性，获得在化地基因中插入一拷贝心天冬氨酸a駿化酶基因的重组 菌讯
[0016] 通过同源重组将由四个DNA片段组成的2-1 ? 2-2 ? 2-3 ? 2-4片段整合到大肠杆 菌化21值盼）基因组中tk巧基因中，其中所述2-1 ? 2-2 ? 2-3 ? 2-4片段中，片段2-1为 大肠杆菌化21值E3)基因组（GenBank:AM946981. 2)第2444239-2444839位核巧酸的DNA 片段，片段2-2为质粒祀T30-panDe(序列7)第236-735位核巧酸的DNA片段，片段2-3为 质粒P邸4佑enBank:AY048743. 1)第31-1508位核巧酸的DNA片段，和片段4为大肠杆菌 BL21 〇)E3)基因组（GenBank:AM946981. 2)第 2445379-2445978 位核巧酸的 DNA 片段；
[0017] 丢掉kan抗性，获得在化地基因和tlaB基因中插入两拷贝k天冬氨酸a駿化 酶基因的重组菌。
[0018] 本发明的工程菌用于生产0 -丙氨酸。
[0019] 根据本发明的第二方面提供一种生产0-丙氨酸的方法，包括发酵培养上述工程 菌的步骤。还包括^心天冬氨酸为底物，用所述工程菌进行生物转化，生产0-丙氨酸。
[0020] 本发明将原来在质粒上表达的心天冬氨酸a駿化酶整合到大肠杆菌基因组中， 进一步提高了培养液中心天冬氨酸a駿化酶活性。本发明的工程菌不但避免了菌体在大 规模培养过程中的质粒丢失问题，保证了工业化应用过程中酶活的稳定，而且该工程菌能 够正常生长和表达心天冬氨酸a駿化酶。另外，本发明所构建的工程菌在菌体培养过程 中无需添加抗生素，节约了培养成本和后续污水处理成本，有利于在工业上实现0 -丙氨 酸的生物法生产。
【附图说明】
[0021] 通过W下附图可W更好地理解本发明。
[0022] 图1为标准品溶液的HPLC图谱。
[0023] 图2为工程菌甲、工程菌己、工程菌丙和工程菌了发酵液经细胞破碎后得到的上 清液的酶活柱形图。
[0024] 图3为生物转化过程中转化体系中生成的0 -丙氨酸浓度随时间变化的曲线图。 [00巧]图4中A为根据本发明的方法构建PAND-1菌株时片段化地-panDe-kan-化地的 电泳图；B为验证构建的PAND-1-1菌株中是否带有化地-panDe-kan-化地片段的电泳图；C 为验证构建的PAND1菌株中已丢掉卡那霉素抗性的电泳图。
[0026] 图5中A为根据本发明的方法构建PAND-2菌株时片段tlaB-panDe-kan-tktB的 电泳图；B为验证构建的PAND-2-1菌株中是否带有tlaB-panDe-kan-tlaB片段的电泳图；C 为验证构建的PAND2菌株中已丢掉卡那霉素抗性的电泳图。
[0027] 图6为重组菌株PAND-1和PAND-2在不同温度下培养12小时后培养液中k天冬 氨酸a駿化酶活性检测结果。
[002引图7为根据本发明实施例将编码枯草芽抱k天冬氨酸a駿化酶的基因插入大肠 杆菌化21 0E3)的同源重组方法示意图，其中
[0029] A为野生型炬L2UDE3))大肠杆菌基因组中用引物化地-for和化地-rev通过PCR 获得1735bp DNA片段；
[0030] B为将片段化地-panDe-kan-Fr地插入到基因组后，用引物化地-For和化