一种防治果树rna病毒的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种防治果树RNA病毒的方法。
【背景技术】
[0002] 果树病害主要是真菌病害，细菌病害和病毒病害（包括病毒、类病毒、类立克次 体、类细菌等）三大类。目前人们对病毒病害认识还不足，重视不够。随着全球果树业的发 展，果树面积不断扩大，果树病毒病害对长期采用营养繁殖的果树危害面积和程度也越来 越大，造成许多果树生长不良，产量下降，品质变劣，树体表现出许多不正常现象，给果树生 产带来巨大的经济损失，而且该损失仍有不断蔓延的趋势。
[0003] 苹果裡绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spotvirus，ACLSV)、苹果莖沟病毒 (Apple stemgrooving virus，ASGV)和苹果莖痕病毒（Apple stem pitting virus，ASPV) 是危害苹果树和梨树的三大主要病毒，三者均为RNA病毒。ACLSV、ASPV和ASGV在寄主上 呈现不表现症状，即外观上无明显症状，故又称为潜伏侵染，不易被人发现，只有在对该病 毒非常敏感的指示植物上才能表现出特有症状。ACLSV、ASGV和ASPV几乎存在于所有苹果 和梨产区，有些苹果和梨品种的潜带率已经饱和，20世纪50年代困扰日本果树界的富士苹 果高接病被证实是由ACLSV、ASPV和ASGV单独或复合侵染造成的。20世纪80年代在我国 的一些果产区中也发现ACLSV、ASPV和ASGV常在一定的砧穗组合上引起嫁接不亲和，此外， 还可引起枝条生长异常，枝条稀疏，树势衰退，造成严重减产，果品质量受到恶劣影响。
[0004] 苹果树和梨树的病毒病害属于难治疗病害，多年来人们还没有研制出一种有效的 防治药剂，较为可行的控制措施是培育无病毒苗和无毒化栽培，无毒苗培育常采用微茎尖 组织培养结合热处理技术，同时配合灵敏、高效、专一的检测方法，而无毒化栽培则需要在 无毒苗培育的基础上辅以严格的园地选择、整形修剪、肥水管理等一系列繁琐、复杂的栽培 条件，给苹果和梨病毒病的防治工作带来了巨大的困难，不仅防治工作量大，复杂繁琐，而 且防治成本极高。
[0005] RNA干扰技术（RNAi)是近几年发展起来的一种非常先进的分子生物学技术，广泛 应用于大规模的功能基因组解析、抗病以及生长发育的调控等方面。作为实现RNA干扰的 一种手段，siRNA在生物体内有着诱发RNA干扰的作用，由此达到抑制病毒、防治病毒病的 效果。目前RNA干扰技术在线虫、果蝇以及植物中的应用已取得了很多成果，在哺乳动物中 的研宄和应用也已取得长足进展。RNA介导的基因沉默是植物在基因调控水平上的自我保 护机制，在对抗病毒侵染、DNA侵入、DNA转座和重排中发挥重要作用，具有普遍性。
【发明内容】
[0006] 本发明为解决现有技术中果树病毒病害防治方法繁琐、复杂等问题，提供了一种 以现代生物技术为基础，操作简便、速度快、成本低、起效快、实时性强的防治果树RNA病毒 的方法。
[0007] 本发明的发明点在于：将RNAi引入苹果和梨病毒病害的防治，根据ACLSV、ASPV和 ASGV外壳蛋白基因的部分保守序列设计ACLSV、ASPV和ASGV的siRNA。利用植物气孔及 其表皮细胞吸收siRNA，siRNA进入细胞后，通过RNA干扰原理降解了病毒外壳蛋白基因的 mRNA，使得病毒无法复制，起到了抑制病毒、防治病毒病的效果。
[0008] 本发明的第一个目的是保护一种防治果树RNA病毒的siRNA序列，ACLSV的siRNA 序列如SEQ ID NO. 1所示，ASGV的siRNA序列如SEQ ID NO. 2所示，ASPV的siRNA序列如 SEQ ID NO. 3 所示。
[0009] 本发明的另一个目的是保护一种防治果树RNA病毒的方法，包括以下步骤：
[0010] (1)根据ACLSV、ASPV和ASGV外壳蛋白基因的部分保守序列设计ACLSV、ASPV和 ASGV 的 siRNA ;
[0011] 所述的 ACLSV 的 siRNA 序列为：5' -UUGGAGUUCAAUAAGGGUCUG-3'，
[0012] ASGV 的 siRNA 序列为：5' -AACCUGGGUCGCGGUCUUGGAC-3'，
[0013] ASPV 的 siRNA 序列为：5' -ACUGAGCGGUGUACGUUGAGGCA-3' ；
[0014] (2)配制浓度为 0? 1 y mol/L ~1. 2 y mol/L 的含 ACLSV、ASPV 和 ASGV 的 siRNA 双 蒸水混合溶液；其中ACLSV、ASPV和ASGV的siRNA的质量配比为1:1:1 ;
[0015] (3)向ACLSV、ASPV和ASGV的siRNA双蒸水混合溶液中加入展着剂吐温-80,其中 展着剂吐温-80的体积百分数为1 %~10% ;
[0016] (4)将步骤（3)所得混合液喷施在果树的叶片表面，溶液喷布细致、周到。
[0017] 进一步的，所述步骤（4)在每年的6~8月果树生长旺盛时期，向果树的叶片表面 喷施步骤（3)所得混合液。
[0018] 进一步的，所述果树为苹果树或梨树。
[0019] 本发明采用已建立的RT-PCR体系对喷施过siRNA混合溶液的苹果树和梨树进行 ACLSV、ASPV和ASGV的检测，检测结果表明实验前的树体中均携带ACLSV、ASPV和ASGV，而 实验后于不同时间取样检测的结果均表明树体中已经不携带ACLSV、ASPV和ASGV。由此证 明，本发明已取得了很好的防治效果，作为一种操作方法简便、效果明显、使用成本低的苹 果和梨病毒病防治方法，采用RNAi防治苹果和梨病毒病具有良好的应用前景。
[0020] 本发明与现有技术相比，有益效果在于：（1)首次采用RNA干扰技术防治ACLSV、 ASPV和ASGV病毒病；(2)首次合成ACLSV、ASPV和ASGV的siRNA ; (3)采用叶面喷施法，用 体积百分数1~10%的吐温-80 (Tween-80)作为展着剂，将ACLSV、ASPV和ASGV的siRNA 引入苹果树和梨树体内；(4)本发明操作方法简便，速度快，实时性强，效果明显，使用成本 低，易于推广。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例，对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于说明本发明而非用 于限定本发明的范围，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规方法操作。
[0022] 实施例1~6中，每个实施例选择的平果树品种有：红富士、金冠、新红星、乔纳金 和秦冠共5个品种，每个品种选择5株树，总计150株海个实施例选择的梨树品种有：三季 梨、巴梨和鸭梨共3个品种，每个品种选择5株树，总计90株。
[0023] 在实验前，从每株果树上摘取叶片若干，置于冰壶中低温保存，便于实验后期进行 RT-PCR检测分析。利用ACLSV、ASPV和ASGV外壳蛋白基因序列设计引物，进行总RNA的逆 转录（RT)和聚合酶链式反应（PCR)，由上述RT-PCR检测结果检验siRNA对ACLSV、ASPV和 ASGV的防治效果。
[0024] 实施例1
[0025] 1、喷洒果树
[0026] 实验时间：2009年6月16日晴，傍晚五点；
[0027] 实验地点：大连市金州区某12年生苹果树园和某15年生梨树园；
[0028] 每个苹果品种和梨品种各选5株树，在实验处理前，每株树摘取叶片若干，置于冰 壶中低温保存，用于进行RT-PCR检测分析。根据ACLSV、ASPV和ASGV外壳蛋白基因的部分 保守序列设计ACLSV、ASPV和ASGV的siRNA;
[0029]所述的 ACLSV 的 siRNA 序列为：5' -UUGGAGUUCAAUAAGGGUCUG-3' ；
[0030] ASGV 的 siRNA 序列为：5' -AACCUGGGUCGCGGUCUUGGAC-3' ；
[0031] ASPV 的 siRNA 序列为：5' -ACUGAGCGGUGUACGUUGAGGCA-3' ；
[0032] 将ACLSV、ASPV和ASGV的siRNA按照质量配比1:1: 1，配制成浓度0.1ymol/L的 双蒸水混合溶液；向ACLSV、ASPV和ASGV的siRNA双蒸水混合溶液中加入体积百分数分别 为1%、3%、5%、7%和10%的展着剂吐温-80,将配好的溶液分别喷于每株树的叶片表面 上，溶液喷布细致、周到。
[0033] 2、病毒检测
[0034] 分别于2010年7月10日、2012年7月16日和2014年7月25日在实验植株上 取叶片若干，置于冰壶中低温保存，带回实验室用于RT-PCR检测分析。对每株树上喷前和 喷后采摘的叶片分别称取100~200mg，重复3次称量，采用已经建立的RT-PCR检测体系 进行ACLSV、ASPV和ASGV的检测。检测结果表明：喷布0? 1 y mol/LACLSV、ASPV和ASGV的 siRNA混合溶液之前的树体中均携带ACLSV、ASPV和ASGV病毒，而喷洒后于不同时间取样 检测的结果均表明所有实验植株树体中已经不携带ACLSV、ASPV和ASGV病毒。
[0035] 实施例2
[0036] 1、喷洒果树
[0037] 实验时间：2009年7月20日晴，傍晚五点；
[0038] 实验地点：大连市金州区某12年生苹果树园和某15年生梨树园；
[0039] 每个苹果品种和梨品种各选5株树，在实验处理前，每株树摘取叶片若干，置于冰 壶中低温保存，用于进行RT-PCR检测分析。根据ACLSV、ASPV和ASGV外壳蛋白基因的部分 保守序列设计ACLSV、ASPV和ASGV的siRNA;
[0040]所述的 ACLSV 的 siRNA 序列为：5' -UUGGAGUUCAAUAAGGGUCUG-3' ；
[0041] ASGV 的 siRNA 序列为：5' -AACCUGGGUCGCGGUCUUGGAC-3' ；
[0042] ASPV 的 siRNA 序列为：5' -ACUGAGCGGUGUACGUUGAGGCA-3,；
[0043] 将ACLSV、ASPV和ASGV的siRNA按照质量配比1:1: 1，配制成浓度0.3ymol/L的 双蒸水混合溶液；向ACLSV、ASPV和ASGV的siRNA双蒸水混合溶液中加入体积百分数分别 为1%、3%、5%、7%和10%的展着剂吐温-80,将配好的溶液分别喷于每株树的叶片表面 上，溶液喷布细致、周到。
[0044] 2、病毒检测
[0045]分别于2010年7月10日、2012年7月16日和2014年7月25日在实验植株上取 叶片若干，置于冰壶中低温保存，带回实验室供进行RT-PCR检测分析之用。对每株树上喷 前和喷后采摘的叶片分别称取100~200mg，重复3次称量，采用已经建立的RT-PCR检测体 系进行ACLSV、ASPV和ASGV的检测。检测结果表明：喷布0. 3 y mol/LACLSV、ASPV和ASGV 的siRNA混合溶液之前的树体中均携带ACLSV、ASPV和ASGV病毒，而喷洒后于不同时间取 样检测的结果均表明所有实验植株树体中已经不携带ACLSV、ASPV和ASGV病毒。
[0046] 实施例3
[0047] 1、喷洒果树
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