一种调节蔗糖合成的水稻基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种调节蔗糖合成的水稻基因Os-ER-ANTl 及其编码的蛋白与应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是我国的重要粮食作物，中国水稻播种面占全国粮食作物的1/4,水稻的有效 穗、结实率、千粒重和籽粒充实度是构成产量的重要因素，这些因素与糖代谢有着一定的关 系。
[0003] 蔗糖是光合作用的主要终产物之一，是多数植物体内长距离运输碳水化合物的主 要形式，它不仅为库器官进行的各项生理活动提供能量，同时也是某些植物如甘蔗、甜菜、 胡萝卜等贮藏的主要化合物。
[0004]植物中与蔗糖代谢有关的酶有三类，分别是转化酶或G-呋喃果糖苷酶（Inv)、蔗 糖磷酸合成酶（SPS)、蔗糖合成酶（SUSy)，其中蔗糖合成酶是催化蔗糖代谢的关键酶之一。 除此之外，寻找调节蔗糖合成相关基因，将为作物改良提供新的选择。
[0005] 三磷酸腺苷（ATP)是生物体内主要的能源载体。ATP/ADP转运蛋白是真核生物的 一种腺苷酸转运载体，是质体ATP浓度的主要调节者。发明人通过对编码水稻ATP/ADP转 运蛋白的编码基因Os-ER-ANTl基因的研究，发现该基因能够调节植物的蔗糖合成，该基因 与光合作用密切相关。
【发明内容】
[0006] 为研究植物蔗糖合成的机理以及光合作用的机理，本发明目的是同一种调节蔗糖 合成的基因Os-ER-ANTl及其编码蛋白与应用。
[0007] 本发明提供了 Os-ER-ANTl基因在调节植物蔗糖合成中的应用，所述Os-ER-ANTl 基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。Os-ER-ANTl基 因为编码ATP/ADP转运蛋白的水稻基因。
[0008] 优选地，所述的植物为水稻。
[0009] 本发明提供了 Os-ER-ANTl基因在植物育种中的应用。
[0010] 本发明还提供了 Os-ER-ANTl基因在培育转基因植物中的应用。
[0011] 本发明还提供用于扩增Os-ER-ANTl编码区基因的引物对。
[0012] 其中，该引物对其中的每一个引物的长度为15到25个碱基，例如：
[0013]上游引物：5' -GGATCCAAATCCGCCGTCGACGATGCCA-3'（如 SEQ ID No. 3 所示的核苷 酸序列）
[0014] 下游引物：
[0015] 5,-ACTAGirCATCTAGAITTCAATGCCCCTTTCATCTTG-3，（如 SEQ ID No. 4 所示的核苷 酸序列）
[0016] 本发明的有益效果在于：本发明的Os-ER-ANTl基因缺失，表现为水稻Os-ER-ANTl 基因失活，直接引起蔗糖合成受阻，造成突变体3叶期后迅速死亡，通过本发明的实验，证 实了 Os-ER-ANTl是具有重要功能的看家基因，能够调节植物体内蔗糖合成，对植物体内蔗 糖代谢具有重要的正向调节作用，为培育植物新品种提供了基因资源。
【附图说明】
[0017] 图1为实施例1中Os-ER-ANTl突变体表型，图中分别为12天，15天以及25天时 的水稻Os-ER-ANTl突变体表型，其中WT为中花11。
[0018] 图2为实施例2中Os-ER-ANTl突变体Ds插入突变位点，其中A图为er-antl突 变体在基因组上的插入位点；B图为ER-ANT1基因的结构示意图。
[0019] 图3为实施例3中RNAi株系的表型照片。A图为野生型和RNAi转基因植株的表 型，B图为野生型和RNAi转基因株系中Os-ER-ANTl基因表达。
[0020] 图4为实施例4中回复突变体的表型照片。A图为缺失突变体以及回复突变测序 结果，B图为回复突变的表型，C图为回复突变体中OsER-ANTl基因的表达丰度。
[0021] 图5为实施例5中WT和突变体中在播种第10天、13天以及16天不同时间点可溶 性糖含量分析。图5A为果糖的变化曲线，图5B为葡萄糖的变化曲线，图5C为蔗糖的变化 曲线。
[0022] 图6为实施例6中突变体在无蔗糖和有蔗糖的条件下的表型。
【具体实施方式】
[0023] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范 围。
[0024] 实施例中pCUbil390载体为常用的载体，pEasy-Tl可市购；水稻品种为粳稻中花 11 ;农杆菌GV3101和EHA105菌株常用的菌株，多数分子生物学实验室均有保存。
[0025] 实施例中的主要试剂为：限制性内切酶、Taq酶、T4连接酶、Pyrobest Taq酶、K0D、 RNase A、M_MLV反转录酶等购自于TAKARA(大连）、？1'〇1116〖3、呢13、1'〇7〇13〇等生物公司；(11'01:>8 购自于Genestar公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自于上海捷瑞生物工 程公司；TRLzol RNA提取试剂盒购自于Invitrogen公司；MS培养基，琼脂粉，琼脂糖，氨 苄青霉素（Amp)、卡那霉素（Kan)、硫酸庆大霉素（Gen)、利福平（Rif)等抗生素以及DEPC、 Galactose、Glucose、BSA、尼龙膜、硝酸纤维素膜、LBMedium等购自Sigma，硝酸纤维素膜购 自Amersham、Bio-Rad等公司；实施例中所使用的其它化学试剂均为进口或国产分析纯。
[0026] 实施例中所使用的引物由Invitrogen公司合成，并进行测序。
[0027] 实施例lOs-ER-ANTl突变体表型分析
[0028]WT和0s-er-antl突变体植株在稻田中生长，12天，15天以及25天时，取材，洗净， 拍照。突变表型见图1。er-antl突变体2叶期前叶色与野生型无明显差异（图1中12天 图），三叶期后突变体变为淡绿色（图1中15天图），并迅速焦枯（图1中25天图）。
[0029] 实施例20S-ER-ANT1突变位点分析
[0030] 提取突变体叶片中的基因组DNA，利用TAIL-PCR的方法扩增Ds插入突变的5'和 3'末端，Ds插入位点位于11号染色体上的编码OsER-ANTl的基因上，详见图2。
[0031]采用TAIL-PCR的方法Liu等（1995)【LiuYG，Mitsukawa N，0osumi T et al. Efficient isolation and mapping of Arab i dop s i s thaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR.Plant Journal,1995, 8 (3) : 457-463】来扩增Ds插入子两侧的序列，具体操作如下：
[0032] 左右边界的特异引物设计采用Primer Premier5。反应条件参照Liu等（1995)的 方法进行(表1 )，反应所用引物见表2,特异扩增得到的第三轮PCR产物用来测序。
[0033] 突变体的Ds3'端TAIL-PCR扩增。Ds插入位点的旁侧序列扩增采用TAIL-PCR，3 轮特异引物依次为Ds3< -la、Ds3< -2a、Ds3< -3a，随机引物用AD3。第3轮PCR产物电 泳检测后送公司测序，测序所用的引物为TAIL-PCR第3轮引物。
[0034] 突变体的Ds5 '端TAIL-PCR扩增。Ds插入位点的旁侧序列扩增采用TAIL-PCR， 扩增的条件见表1，3轮特异引物依次为Ds5' -la、Ds5' -2a、Ds5' -3a，随机引物用AD1。 第3轮PCR产物电泳检测后送公司测序，测序所用的引物为Ds5' -3a。
[0035] 表1TAIL-PCR循环条件
[0036]
【主权项】
1. Os-ER-ANTl基因在调节植物蔗糖合成中的应用，其特征在于，所述Os-ER-ANTl基因 核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的植物为水稻。 3. Os-ER-ANTl基因在植物育种中的应用，所述Os-ER-ANTl基因核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。 4. Os-ER-ANTl基因在培育转基因植物中的应用，所述Os-ER-ANTl基因核苷酸序列如 SEQ ID No. 1 所示。
5. 用于扩增Os-ER-ANTl基因的特异性引物，其特征在于，核苷酸序列为：上游引物：5' -GGATCCAAATCCGCCGTCGACGATGCCA-3' ；下游引物：5' -ACTAGTTCATCTAGATTTCAATGCCCCTTTCA TCTTG-3，。
【专利摘要】本发明提供一种调节蔗糖合成的水稻基因Os-ER-ANT1，该基因缺失导致水稻Os-ER-ANT1基因失活，引起蔗糖合成受阻，造成突变体3叶期后迅速死亡，表明Os-ER-ANT1是具有重要功能的看家基因，对水稻蔗糖代谢具有重要的正向调节作用。本发明不仅为研究水稻蔗糖合成的机制奠定基础，而且为研究Os-ER-ANT1蛋白的生物学功能及应用水稻Os-ER-ANT1基因改良作物品种提供了基础。
【IPC分类】A01H5-00, C07K14-415, C12N15-82, C12N15-11, C12N15-29
【公开号】CN104673804
【申请号】CN201310629419
【发明人】张向前, 杨建平, 宋梅芳, 郭林, 郑旭, 苏亮
【申请人】华南农业大学, 中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2013年11月29日