拟南芥长链脂肪醇氧化酶基因及其编码蛋白与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程领域，涉及植物基因及其编码蛋白与应用，特别涉及一 个来源于拟南芥的长链脂肪醇氧化酶基因及其编码蛋白与其在提高植物抗冷性上的新应 用。
【背景技术】
[0002] 地球上的陆地只有三分之一面积可维持温度在0°C以上，42%的土地都将经 历-20°C以下的低温。在这些区域，植物需要特殊的机制适应低温环境。通常情况下，冷胁 迫可根据温度的不同分为冷害（〇_15°C )和冻害（<0°C )。生长于温带的植物，如拟南芥、菠 菜等，具有不同程度的冷害耐受力，将其置于低温环境，经过低温驯化可以提高它们的冻害 耐受力，而生长于热带、亚热带地区的植物不具备冷害的耐受力，缺乏低温驯化机制。
[0003] 在我国，低温冷害是影响农业生产持续稳定发展的重要灾害之一。它具有大尺度 性、综合性及地区差异性等特点。严重灾害年可使我国粮食减产达200亿斤左右。随着我 国各地种植制度的改革，复种指数增加，晚熟高产品种得到推广应用，如遇低温年，灾害的 影响和造成的损失将更加突出。因此，加强植物对低温冷害抗性分子机制的研宄，对农业稳 定和国民经济的发展都具有重大而深远的意义。
[0004] 1、植物抗冷胁迫研宄现状
[0005] 抗冷反应是一个复杂过程，涉及很多不同的代谢途径、基因调节和细胞反应。为了 适应低温胁迫，植物的基因表达和新陈代谢都发生了很多的变化。目前，人们关于植物耐受 低温胁迫的分子基础方面已经展开了大量的研宄，主要集中在ICE-CBF/DREB1抗冷信号传 导途径和冷应答基因的调节。
[0006] L 1ICE-CBF/DREB1 信号传导途径
[0007] 在所有的抗冷相关的信号途径中，CBF/DREB1依赖型信号途径是最具特色的关键 调节通路。拟南芥中有三个CBF/DREBls可调节冷应答基因的表达增强植物耐寒性。CBF/ DREB1 (尤其是CBF3/DREB1A)通路受MYC-型转录因子ICE1调控表达。
[0008] 拟南芥ICE1突变体对冷害和冻害均表现敏感，过表达ICE1可明显增强植物抗冻 能力。低温条件下，ICE1可以与CBF3/DREB1A启动子中的MYC识别元件结合，诱导CBF3/ DREB1A的表达。ICE1可调控大约40%的冷应答基因和46%的冷调控转录因子的表达， 是CBF3/DREB1A及冷应答基因的主调节器.ICE1突变体可以影响CBF1/DREB1B和CBF2/ DREB1C的早期冷诱导表达，但是过一段时间这种影响就消失了，这表明，有其它的ICE1-类 蛋白可以介导CBF1/DREB1B和CBF2/DREB1C的冷诱导表达。随后，研宄表明，ICE2(-种 ICE1-类蛋白）超表达突变体，增强了拟南芥CBF1/DREB1B的表达及冷胁迫抗性。冷处 理过后，伴随着染色质解凝，高度乙酰化的组蛋白H3\H4及DNA甲基化出现在玉米启动子 ZmDREBl中的ICE1-结合区，HDACs(组蛋白脱乙酰基酶类）可以选择性地激活表达，从而调 节ICE1-结合区与ICE1的结合，以调控植物的冷诱导信号系统。还有研宄表明ICE1受泛 素化和苏素化作用的调节。然而，ICE1具体的激活机制及从感知冷胁迫、第二信使到ICE1 的信号传导途径依然是待解的谜团。（图1)
[0009] 1. 2 冷调控基因 Cold-Regulated Genes
[0010] 目前很多研宄表明成功的转基因处理可以增强植物对低温的耐受力。菠菜、南瓜 和拟南芥叶绿体中的GPAT (3-磷酸甘油酰基转移酶）参与磷脂酰甘油的去饱和作用，增强 了植物细胞膜中不饱和脂肪酸的比率，该基因的超表达可增强植物的抗冷能力；柑橘的脱 水蛋白基因，CUC0R19,可降低转基因烟草的脂质过氧化，增强抗冷性；类似的，小麦脱水蛋 白 WCS19,拟南芥 C0R15A，及 RAB18 和 C047 共表达或者 LTI29/XER02 和 LTI30/ERD10 共表 达，均可增强转基因拟南芥植株的抗冷性；转小麦脱水蛋白基因WC0410的草莓叶片可提高 耐冻性；过表达水稻TPP1 (6-磷酸海藻糖磷酸酶）的水稻植株抗冷性明显提高，由于海藻糖 是一个非还原的二塘，在植物体内可以作为压力保护代谢物，起到防护功能，海藻糖的大量 积累，不仅可以增强植株的耐寒性，还对其它的非生物胁迫起到抗性作用。
[0011] 1.3其它抗冷机制
[0012] 除了抗冷信号传导途径和抗冷相关基因外，还有其它的一些增强植株耐冷性的方 式逐渐被人们所认识，如一些转录后、翻译后修饰，泛素化和苏素化作用可通过调整ICE1 从而调控抗冷信号系统，时钟基因的可变性剪辑也可调整抗冷信号等等。虽然人们在抗冷 方面进行了很多研宄，然而，植物抗冷机制仍然存在许多未知，有待人们更加深入、全面的 研宄和探索。
[0013] 2、长链脂肪醇氧化酶（fatty alcohol oxidase，FA0)研宄现状
[0014] FA0作为《 -氧化代谢途径中一个关键性酶，可将《 -长链脂肪醇氧化成醛，应用 于二元羧酸的工业生产。目前，已报道的从人、假丝酵母、热带假丝酵母、百脉根中克隆得到 的长链脂肪醇氧化酶均具有重要的商业应用价值。
[0015] 长链脂肪酸氧化代谢途径首先发现于假丝酵母中，其利用长链脂肪酸或长链 的烃类物质作为唯一碳源进行代谢产能，这条长链脂肪酸氧化代谢途径由两类基本的 氧化酶组成：一类长链脂肪酸P450羟基酶和一类长链脂肪醇氧化酶（FA0)，其终 产物是二元羧酸。近年来，关于植物脂肪酸氧化代谢途径的相关研宄得到了科学家们 的广泛重视，发现了多个长链脂肪酸P450羟基酶能催化氧化长链脂肪酸成为长链 脂肪醇。而且，这些羟基酶不仅参与脂肪酸代谢，还通过调节其产物或影响脂肪酸代谢 途径中的其它因子，从而在植物其它信号传导途径、次生代谢、生长发育及其它生理功能中 发挥重要作用。植物氧化代谢途径中的脂肪酸可通过参与一些信号分子的合成，起到 调节角质层形成的作用，从而影响植物细胞壁角质层的组成成分，结构和厚度；细胞表皮中 角质素相关的P450羟基酶可抑制细菌III型分泌系统相关基因在细胞间隙的表达；《 -羟 基酶还可控制逆境中磷脂酶诱发的游离脂肪酸的大量积累，降低其毒性水平。水稻《-长 链脂肪酸P450羟基酶对于水稻花药cutin蛋白的合成和花粉外壁形成是至关重要的。拟 南芥中的羟基酶还可影响表皮毛的分化，顶端优势的确立及植株衰老。
[0016] 但是，植物中关于脂肪酸氧化代谢途径的另一个关键酶FA0研宄的相对较 少。2004年，本课题组首次发现，在高等植物中也有Fao编码与脂肪酸氧化代谢相关的 长链脂肪醇氧化酶（FA0)，并通过体外实验证明其作用是将长链脂肪醇氧化成醛， 进而转化成二元羧酸，从而进入经典产能的0 _氧化循环或者直接作为植物细胞壁的结构 组成部分参与细胞壁的合成（图2,图中标注了和脂相关的胁迫信号分子（JA，MJ，CJ)和 可能的功能与各个长链脂肪酸或者脂肪醇在这个途径中的相应位置）。2013年，Rajangam 等，在加州希蒙得木中发现ScFao基因，并证实其与拟南芥中的AtFao同样具有将长链脂 肪醇氧化成醛的作用，此外，还发现该基因在加州希蒙得木种子萌发中起非常重要的作用， 推测其可能是种子萌发后液体蜡酯（C20，C22，C24)代谢的必要条件。再此期间，2006年， Kurdyukov等在拟南芥中发现了一个与FA0具有相同催化功能，但是蛋白同源性却很低的 的氧化还原酶基因HTH，该基因突变体细胞的角质层厚度只有对照的十分之一，并且细胞壁 角质层的组成组分中a-，W-二羧基脂肪酸的含量明显减少，推测该基因参与植物体内W-氧 化途径。此外，无其它关于植物FA0生理功能的相关报道，涉及该基因的研宄报道多集中 在其作用底物和亚细胞定位上。FA0可以以1-十二烷醇、1-十六烷醇、1、16-十六烷二醇， C4-C18饱和脂肪酸及C20:1-C24:1混合单链不饱和脂肪酸，为催化底物进行催化反应。序 列分析表明拟南芥AtFAOl，百脉根L jFA02，酵母Fao，加州希蒙得木ScFao，均具有内质网定 位信号。并且有相关研宄证明其可能定位于内质网，或者，所有与油体相关的细胞器膜，也 有可能与其下游反应基因一样定位于细胞质。
[0017] 本课题组在进行2010年国家自然科学基金（高等植物长链脂肪酸氧化代谢 途径及其生物学意义的研宄）研宄工作的同时，对拟南芥AtFao进行了的初步研宄。以假 丝酵母Fao序列为搜索引物，在水稻和拟南芥基因组中各发现4个尚未明确注释的Fao同 源序列。此外，在几乎所有已知基因组序列的高等植物中均发现了 Fao的存在，比如油菜、 大豆、百脉根、玉米、番茄等等，推测其可能直接作为植物细胞壁的结构组成部分参与细胞 壁的合成。
[0018] 当植物处于低温胁迫条件的时候，细胞膜的流动性和蛋白组分会发生改变，膜脂 质发生大量变化，这种变化对诱发植物从结构和信号传导两方面对冷环境的适应性起到非 常关键的作用。拟南芥中冷胁迫诱导的CBFs或者DRE-结合因子的发现，使得人们对冷调 苄基因（C0R)有了更具体、深入的了解，但AtFa 〇4b基因是否对植物抗冷具有重要的作用还 有待进一步研宄。
【发明内容】
[0019] 本发明的第一目的是提供一种拟南芥长链脂肪醇氧化酶基因的核苷酸序列。
[0020] 本发明的第二目的是提供上述拟南芥长链脂肪醇氧化酶基