生鲜果蔬食品中致病菌检测试剂盒及检测方法
【技术领域】 [0001] 本发明涉及一种食品中致病菌快速检测试剂盒及其检测方法。
【背景技术】 [0002] 水果蔬菜中富含人体必需的维生素、有机酸、无机盐和植物纤维等营养 成分，而即食生鲜果蔬食品因为食用方便、口味清新和味道鲜美，更是人们日常生活中和餐 桌上常见的食物。但是，生鲜果蔬食品仅经简单清洗，未经高温杀菌处理，其表面和内部附 着的微生物，尤其是金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌等水果蔬菜中常见的致病菌因 而可能部分残留，对生鲜果蔬食品的食用安全性造成了极大的隐患。因而，对生鲜果蔬食品 中致病菌的快速、准确的检测和鉴定技术就显得格外重要了。目前，我国对生鲜果蔬食品中 致病菌的检测仍以常规的微生物学检测和鉴定方法为主。它的不足之处：费时、费力，且难 以快速、准确的进行检测，检测成本高。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种省时、省力，且能够快速、准确的进行检测，节 约检测成本的生鲜果蔬食品中致病菌多重聚合酶链式反应检测试剂盒。
[0004] 本发明所述的检测试剂盒，其中各组分组成及浓度为：⑴检测金黄色葡萄球菌的 引物：上游引物 5'-TGC GAA ACA TCC ACG ACA TA-3'，下游引物 5'-CGT ITG TGC TGA ITT CCC TAC-3'，浓度为0.5~2.0ymol/L⑵检测沙门氏菌的引物：上游引物5'-GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA-3'，下游引物 5' -TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C-3'，浓度 为0. 5~2. Oymol/L，⑶检测大肠杆菌的引物：上游引物5'-GGC GGA TAA GAC TTC GGC 丁八-3'，下游引物5'-〇6!'1'17 66〇4(^41'1'16〇〇：-3'，浓度0.5~2.0 11111〇1/1^4)镁盐， 浓度为1. 〇~2. 0 y mol/L，(5)脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP)，浓度为0. 15~0. 25 y mol/L， (6) 10X聚合酶链式反应（PCR)反应缓冲液5. 0 y L，(7)水生栖热菌（Taq)DNA聚合酶1. 0~ 3. 0U，用灭菌无离子水补足体积至50. 0 yL。其中，镁盐为氯化镁或硫酸镁。
[0005] 应用上述试剂盒对生鲜果蔬食品中致病菌进行检测的方法具体如下：
[0006] (1)无菌操作取样品放入无菌均质袋（内含100mL无菌生理盐水）中在均质仪上 拍打混匀，取1. 0mL样液无菌操作涂于LB肉汤固体平板，37°C恒温培养24h。在无菌条件下 将单菌落分别挑入各灭菌离心管中，分别加50 yL Lysis Buffer细胞裂解液，80°C水浴裂 解20min，1000r/min离心10min，取上清作为聚合酶链式反应（PCR)模板液；
[0007] (2)将待检样品菌体制备的基因组DNA模板添加到检测试剂盒中，试剂盒内各 组分组成及浓度为：检测金黄色葡萄球菌的引物0. 5~2. 0 ymol/L，检测沙门氏菌的引 物0? 5~2. 0 y mol/L，检测大肠杆菌的引物0? 5~2. 0 y mol/L，镁盐1. 0~2. 0 y mol/ L，脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP)0. 15~0. 25ymol/L，10X聚合酶链式反应（PCR)反应 缓冲液5. 0 y L，水生栖热菌（Taq)DNA聚合酶1. 0~3. 0U，用灭菌无离子水补足体积至 50. 0 y L。各致病菌DNA模板各3 y L，按现有技术，在聚合酶链式反应（PCR)扩增仪（Thermo Scientific，型号：Arktik)上孵育，聚合酶链式反应（PCR)循环参数为95°C预变性3min ; 95°C变性30s，59°C退火30s，72°C延伸30s，循环32次；72°C终延伸10min，结束聚合酶链式 反应（PCR)扩增；
[0008] (3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，取扩增后的产物5yL点样于1%琼脂 糖凝胶，其中含〇.5 y g/mL嗅化乙锭，以1000bp Marker为标准分子量参照，以5V/cm的电 场强度于0. 5XTBE电泳缓冲液中电泳30min，电泳结果用紫外凝胶成像系统拍照和分析， 待检样品与阳性对照同时扩增出426bp的条带，则判定为金黄色葡萄球菌阳性；待检样品 与阳性对照同时扩增出284bp的条带，则判定为沙门氏菌阳性；待检样品与阳性对照同时 扩增出151bp的条带，贝1」判定为大肠杆菌阳性。
[0009] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明针对生鲜果蔬食品中主要致病菌 而设计，一次可检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌三种致病菌，检测时间由常规检 测的3-5天，缩短为聚合酶链式反应（PCR)检测的30小时以内，省时省力，节约检测成本。
【附图说明】
[0010] 图1为本发明试剂盒对实施例1的检测结果图。
【具体实施方式】
[0011] 实施例1
[0012] (1)无菌操作取香菜样品10g放入无菌均质袋（内含100mL无菌生理盐水）中，在 均质仪上拍打混匀，取1. OmL样液无菌操作涂于LB肉汤固体平板，37°C恒温培养24h。在无 菌条件下将单菌落分别挑入各灭菌离心管中，分别加50 yLLysis Buffer细胞裂解液，80°C 水浴裂解20min，1000r/min离心10min，取上清作为聚合酶链式反应（PCR)模板液；
[0013] (2)将待检样品菌体制备的基因组DNA模板添加到检测试剂盒中，试剂盒内 各组分组成及浓度为：检测金黄色葡萄球菌的引物l.Oumol/L，检测沙门氏菌的引物 1. 0 ymol/L，检测大肠杆菌的引物1. 0 ymol/L，氯化镁1. 5 ymol/L，脱氧核糖核苷三磷酸 (dNTP) 0? 2 y mol/L，10 X聚合酶链式反应（PCR)反应缓冲液5. 0 y L，水生栖热菌（Taq) DNA 聚合酶2. 0U，用灭菌无离子水补足体积至50. 0 y L。各致病菌DNA模板各3 y L，在聚合酶 链式反应（PCR)扩增仪上孵育，聚合酶链式反应（PCR)循环参数为95°C预变性3min;95°C 变性3〇8,59°0退火3〇8,72°0延伸3〇8,32个循环 ；721：终延伸1〇111111，结束聚合酶链式反应 (PCR)扩增；
[0014] (3)取扩增后的产物5yL点样于1%琼脂糖凝胶，其中含0. 5yg/mL嗅化乙锭， 以1000bp Marker为标准分子量参照，以5V/cm的电场强度于0. 5XTBE电泳缓冲液中电泳 30min，电泳结果用紫外凝胶成像系统拍照和分析。
[0015] 从图1中可以看出，四种供检测的香菜样品中均不同程度的检测出金黄色葡萄球 菌、沙门氏菌和大肠杆菌的存在。
[0016] 编号 M 为 1000bp marker ;
[0017] 编号1-4为四种供检测的香菜样品；
[0018] 编号5为金黄色葡萄球菌（426bp);
[0019] 编号6为沙门氏菌（284bp);
[0020] 编号7为大肠杆菌（151bp);
[0021] 编号8为阴性对照。
[0022] 待检样品与阳性对照同时扩增出426bp的条带，则判定编号5的金黄色葡萄球菌 阳性。如待检样品与阳性对照同时扩增出284bp的条带，则判定为编号6的沙门氏菌阳性； 如待检样品与阳性对照同时扩增出151bp的条带，则判定为编号8的大肠杆菌阳性。
[0023] 实施例2
[0024] (1)无菌操作取黄瓜样品10g放入无菌均质袋（内含100mL无菌生理盐水）中，在 均质仪上拍打混匀，取1. OmL样液无菌操作涂于LB肉汤固体平板，37°C恒温培养24h。在无 菌条件下将单菌落分别挑入各灭菌离心管中，分别加50 yLLysis Buffer细胞裂解液，80°C 水浴裂解20min，1000r/min离心10min，取上清作为聚合酶链式反应（PCR)模板液；
[0025] (2)将待检样品菌体制备的基因组DNA模板添加到检测试剂盒中，试剂盒内 各组分组成及浓度为：检测金黄色葡萄球菌的引物2.0 ymol/L，检测沙门氏菌的引物 2. 0 ymol/L，检测大肠杆菌的引物2. 0 ymol/L，氯化镁2. 0 ymol/L，脱氧核糖核苷三磷酸 (dNTP)0? 25 y mol/L，10X聚合酶链式反应（PCR)反应缓冲液5. 0 y L，水生栖热菌（Taq) DNA 聚合酶3. 0U，用灭菌无离子水补足体积至50.0 yL。各致病菌DNA模板各3 yL。在聚合酶 链式反应（PCR)扩增仪上孵育，聚合酶链式反应（PCR)循环参数为95°C预变性3min;95°C 变性3〇8,59°0退火3〇8,72°0延伸3〇8,32个循环 ；721：终延伸1〇111111，结束聚合酶链式反应 (PCR)扩增；
[0026] (3)取扩增后的产物5 y L点样于1 %琼脂糖凝胶，其中含0. 5 y g/mL嗅化乙锭， 以1000bp Marker为标准