一种快速测定特异位点dna甲基化的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学领域，具体而言，涉及一种快速测定特异位点DNA甲基化的 方法。 技术背景
[0002] 人体内的每一个细胞均携带有构成人身体所需的全部成分的编码基因，但其中却 仅有很少一部分处于活跃表达状态。基因的表观遗传修饰如同基因的开关一样，协助控制 基因活性，以确保基因在确定的时间和空间选择性表达。这种特定的基因活性状态信息可 被储存和遗传。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰方式，在哺乳动物基因组中主要表 现为5-甲基胞喃啶（5mC, 5-methyl-cytosine)，且多发生在两个相邻的胞喃啶（Cytosine， C)和鸟嘌呤（Guanine，G)二核苷酸（CpG)的C上。哺乳动物基因组中60%~90%的CpG 都被甲基化，很多个CpG成簇的组成CpG岛，多位于结构基因启动子的核心序列和转录起始 点，通过甲基化水平的变化，参与基因的表达调控。近年来的研宄发现DNA甲基化的异常与 很多诸如肿瘤、精神疾病等重大疾病存在相关，一些基因CpG位点的甲基化程度高低可能 已成为这些疾病发生的潜在标志物。快速检测这些与疾病相关基因的CpG位点的甲基化状 态，对于及时发现和治疗这些疾病非常重要。
[0003] 目前针对基因特异CpG位点甲基化检测多数是基于亚硫酸氢钠转换和PCR扩增 基础上进行的。基因组DNA经亚硫酸氢纳处理后，甲基化的C保持不变，而非甲基化的C 转换尿嘧啶（Uracil，U)并经PCR扩增后变成T。这样对于不完全甲基化的CpG位点C位 置就变成了 C/T的混合，对C的定量就可反映该CpG位点的甲基化水平。目前常用的定 量方法多数是基于甲基化特异引物的单核苷酸延伸标记（Ms-SnuPE)[Gonzalgo ML等人， Nat Protoc. 2007 ;2(8): 1931-6]，然后再依据不同的标记进行分离和定量。例如经典的 质谱或焦磷酸测序法[Colyer HA等人，Methods Mol Biol. 2012;863:281-92]，虽然可以 测定多个位点的甲基化，但是操作复杂，需要较昂贵的仪器和设备，成本也较高；基于限制 性内切酶方法或者基于同位素标记法需通过DNA胶分离[Xiong Z等人，Nucleic Acids Res. 1997 ;25 (12) : 2532-4]，然后进行定量，虽然成本相对较低，但需要复杂的分离或转移 步骤，造成定量结果偏差较大，亦或涉及放射性标记；基于生物素标记或荧光标记能量转移 (FRET)等检测方法[Feng F 等人，Nat Protoc. 2010 ;5 (7): 1255-64]，虽然增加了灵敏度， 但是需要标记、纯化和分离等步骤，增加了操作的复杂性；基于荧光探针的实时定量PCR技 术[Dugast-Darzacq C1 等人，Methods Mol Biol. 2009;507:281-303]，虽然提高了检测的 灵敏度，但是由于探针长度和特异性的要求高，不能检测所有位点。现有方法存在的不足， 限制了其在临床和科研领域的广泛应用。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供一种简便、快速测定特异位点CpG 甲基化的方法。采用单碱基延伸引物末端标记焚光素核苷酸结合焚光偏振（Fluorescence polarization，FP)检测的特异CpG位点甲基化的方法。
[0005] 本发明所述的检测目标生物样本中特定序列DNA的甲基化水平的方法的流程如 图1所示。
[0006] 本发明首先涉及一种检测目标生物样本中特定序列DNA的甲基化水平的方法，该 方法包括以下步骤：
[0007] 步骤（1)，获取生物样本，并提取样本中的待测DNA片段；
[0008] 步骤（2)，用亚硫酸氢钠处理待测DNA，使待测DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨 基转变成尿嘧啶；
[0009] 步骤（3)，以步骤⑵处理完毕的DNA片段为模板DNA，以第一引物和第二引物分 别从模板DNA两侧对模板DNA进行PCR扩增，所述第一引物和第二引物扩增的模板DNA片 段应含有待测DNA片段的CpG位点，且第一引物和第二引物距待测CpG位点的距离应大于 第三引物的长度，第一引物和第二引物的长度为20~30bp，GC含量55-60% ;
[0010] 步骤（4)，碱性磷酸酶对步骤（3)的PCR产物进行消化处理，去除多余的第一引物、 第二引物和dNTPs，并纯化回收；
[0011] 步骤（5)，分别取等量的步骤（4)纯化的PCR产物，在单独的反应体系中进行甲基 化特异第三引物引导的单碱基延伸标记反应：
[0012] 反应一，使用荧光素dCTP用以检测目标CpG位点的甲基化；
[0013] 反应二，使用荧光素dUTP用以检测目标CpG位点的去甲基化；
[0014] 所述标记第三引物的序列与待测DNA的目标CpG位点上游20~30bp序列的对应 互补序列特异结合，长度在22-25bp，不含有CpG位点；
[0015]步骤（6)，将步骤（5)反应一或反应二所得的产物于FP检测仪上，分别测定反应一 产物的荧光素dCTP荧光偏振值，反应二产物的荧光素dUTP荧光偏振值，根据dCTP荧光偏 振值和dUTP荧光偏振值计算待测DNA甲基化水平。
[0016] 所述的焚光素dCTP或dUTP，其焚光素标记基团可以是5_carboxyfluorescein(F AM), 2'Tdimethoxy-4' 5' -dichloro-6-carbosyfjuores-cein(JOI),rhodamine, 6-carbo xy-rhodamine(R6G),5/6-carboxytetramethylrhodamine(TAMRA),6-carboxy-X-rhodamin e(ROX),4-(4' -dimethylaminophenylazo)benzoicacid(DABCYL),或 5_ (2' -aminoethyl) aminonaphthalene-l-sulfonicacid(EDANS)〇
[0017] 步骤（1)所述的待测DNA可以来源于血液样本，病理样本，以及其他器官或组织细 胞样本，所述病理样本优选为肿瘤组织样本，所述肿瘤组织样本优选为肺癌、胃癌、肝癌组 织样本。
[0018] 步骤（1)所述的待测DNA也可以来源于重组DNA或合成DNA。
[0019] 步骤（2)所述的亚硫酸氢钠处理待测DNA的反应参数优选为：
[0020] 1 y g待测DNA与0. 3M NaOH -起在42°C孵育20分钟，然后95°C孵育3分钟和0°C 孵育1分钟；接下来同pH 5. 0的亚硫酸氢纳（终浓度5. 0M)和对苯二酚（终浓度0. 5mM) 在55°C孵育16小时，并保持避光。处理后DNA用PromegaWizardDNACleanSystem进行 纯化，并溶解在〇. 3M的NaOH中，37°C孵育15分钟后用3M的醋酸铵中和至pH7. 0 ;75%的 乙醇沉淀中和产物，并溶解在20 y 1 TE中，保存在-20°C。
[0021]步骤（3)所述的PCR反应参数优选为，
[0022] 15yl反应体系包含：l-2yl来自经步骤（1)处理后的DNA，75nM的引物1和引物 2, 50nM的dNTPs，IX PCR缓冲液，和1个单位的Taq DNA聚合酶；混合物置于95°C反应1分 钟后，进行以下30个循环：95°C加热1分钟，60°C加热1分钟，72°C加热1分钟。
[0023] 步骤（4)所述的碱性磷酸酶对步骤（3)的PCR产物进行消化处理的反应参数优选 为，
[0024] 消化在37. 5 y 1中体系中进行：1X碱性磷酸酶反应缓冲液，3. 4单位碱性磷酸 酶，2. 3单位核酸外切酶和13 y 1 PCR产物；
[0025] 混合物置于37°C反应45分钟，再于85°C加热15分钟使酶失活。
[0026] 步骤（5)所述的单碱基延伸标记反应参数优选为，
[0027] 反应总体积15 y 1，含1. 5 y 1步骤（4)产物，0? 75单位Tag聚合酶，1XPCR Buffer， 3. 75 y M第三引物，1. 125 y M荧光素dCTP或0. 5625 y M荧光素dUTP ;
[0028] 反应条件：95 °C变性3分钟后，进行以下30个循环：95 °C温育30秒，55 °C温育30 秒。
[0029] 本发明还涉及所述的检测目标生物样本中特定序列DNA的甲基化水平的方法在 检测目标DNA甲基化中的应用。
[0030] 本发明采用灵敏度高的荧光素标记的dCTP或dUTP，结合亚硫酸钠处理和PCR和