抑灭霉菌毒素的基因工程重组高纯度抗霉菌毒素单抗和复合单抗制备方法及其组合制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抑灭粮食和饲料以及食品中的霉菌毒素的新方法，更具体地说，涉及 一种抑灭霉菌毒素的基因工程重组高纯度抗霉菌毒素单抗和复合单抗制备方法及其组合 制剂。
【背景技术】
[0002] 近年来，霉菌毒素中毒给畜牧业带来的危害越来越大。据联合国粮农组织调查，全 世界贸易供应的谷物中，有25%受到霉菌毒素的污染。而我国饲料和原料污染霉菌毒素超 标的比例更高达60 %~70 %以上。据统计，有66 %以上的饲料原料至少污染1种霉菌毒素， 35%的饲料原料污染2种以上的霉菌毒，几乎所有的花生柏都污染霉菌毒素，而玉米柏、豆 柏及麸皮等霉菌毒素的含量是整粒谷物含量的30-500倍。在养殖过程中，经常遇到育肥猪 生长速度缓慢、母猪假发情、哺乳仔猪拉稀，蛋鸡产蛋率下降，奶牛奶质不符合要求等，主要 都是霉菌毒素惹的祸；因此，霉菌毒素被称为新"万病之源"。
[0003] 据估计，1986年全世界仅仅由于肉仔鸡吃了被黄曲霉毒素污染的饲料而体重减轻 所造成的直接经济损失约为1. 4亿美元。大量文献报道，霉菌毒素会影响畜禽的全部系统， 引起宏观和组织学方面的变化，影响生长和生产率，影响免疫系统，引起畜禽对许多传染性 疾病易感性增加，导致死亡率上升。因此，霉菌毒素是影响全世界农业、饲料业和养殖业发 展的最大危害。
[0004] 另外，霉菌毒素在畜产品中的残留会对人体健康产生影响。畜禽食品被污染后，人 食用会发生急、慢性中毒，损害身体的肝脏、肾脏、神经组织、造血组织及皮肤组织，甚至出 现致畸、致癌、致突变。目前，霉菌毒素已成为食品安全的最大隐患，其高毒性和强致癌性严 重威胁人类健康。
[0005] 目前，全球针对霉菌毒素采用的处理方法主要有以下几种。
[0006] 1、营养解毒法：可起到一定的解毒效果，但可能造成营养的不均衡，导致有些营养 物质缺乏。
[0007] 2、吸附法（活性炭法和硅酸盐法以及葡聚糖）：活性炭法和硅酸盐法只对黄曲霉 毒素有一定效果，对其他毒素无效；葡聚糖则对玉米赤霉烯酮有一些效果。但是，总体应用 效果较差；最糟糕的是被吸附的毒素会在动物胃肠道中重新释放。另外，由于这种吸附并非 特异性的，在吸附霉菌毒素的同时也吸附了大量的维生素和氨基酸，造成得不偿失。
[0008] 3、碱处理法：处理后原料残留有大量氨，已逐渐被淘汰。
[0009] 4、氧化处理法：处理效果不稳定，饲料中维生素等营养成分损失严重。
[0010] 5、抗氧化剂：不能完全消除黄曲霉毒素中毒症，而且BHT等抗氧化剂浓度均超过 常规使用量的30倍以上才显示较好的去毒效果；这样一来，必然会对动物产生毒害作用。
[0011] 6、高温处理法：能耗高且对饲料中的营养成分破坏大，实际应用很少。
[0012] 7、生物降解：这种吸附作用是可逆的，毒素分子并没有消失，随着培养时间的延 长，部分毒素会重新释放到培养基质中。一些菌株在条件改变的情况下有可能产生毒素。
[0013] 8、酶制剂：降解过程是酶促反应，必须在水的存在下发生反应。解毒酶的理想反应 条件都是中性pH值、高水分的体外反应体系，适合植物油、酱油、啤酒、牛奶等，难以在低水 分饲料和原料中直接应用。
[0014] 鉴于世界各国迄今为止没有理想的对付饲料及食品中的霉菌毒素的方法，也没有 安全且有明显效果的降解霉菌毒素的饲料添加剂，更没有治疗霉菌毒素中毒的特效药，连 目前最负盛名的德国产【霉菌毒素解毒剂】也只是采用传统的葡聚糖吸附法；市场反馈的信 息表明，现有的方法未能解决日益严重的霉菌毒素污染问题。因此，霉菌毒素的危害越来越 严重；给我国和全球的饲料工业和畜牧业生产带来了巨大的经济损失并损害国民健康。更 重要的是，霉菌毒素污染还直接影响到国家粮食安全。
[0015] 因此，寻找一种真正能防控和降解饲料及食品中的霉菌毒素的新方法、新途径，彻 底消除霉菌毒素的污染，已成为当前饲料工业和畜牧业生产以及粮食储备领域面临的一大 难题；同时，这个问题关系到国计民生，是摆在畜牧业和国际医药科学界面前的迫在眉睫的 重大课题。
【发明内容】
[0016] 本发明要解决的技术问题在于，克服现有技术的上述缺陷，提供一种抑灭霉菌毒 素的基因工程重组高纯度抗霉菌毒素单抗和复合单抗制备方法。
[0017] 本发明要解决的又一技术问题在于，提供一种低成本大规模生产抗霉菌毒素单抗 和复合单抗的方法。
[0018] 本发明的另一目的在于，提供一种包含有抗霉菌毒素单抗和复合单抗及其组合制 剂，以直接有效中和及抑灭霉菌毒素，达到从粮食储藏、运输到饲料生产和动物养殖每个环 节全方位消除霉菌毒素危害以及预防和治疗霉菌毒素中毒疾病的目的。
[0019] 针对上述目标，本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
[0020] 构造一种抑灭霉菌毒素的基因工程重组高纯度抗霉菌毒素单抗和复合单抗制备 方法，其中，包括以下步骤：
[0021] A、筛选霉菌毒素；
[0022] B、将活性基团引入已选择的霉菌毒素中，再将霉菌毒素与载体蛋白连接，制备免 疫用抗原；
[0023] C、进行免疫和细胞融合，制得霉菌毒素对应的杂交瘤细胞；
[0024] D、采用已制得的霉菌毒素之杂交瘤细胞，进行抗霉菌毒素单抗Ig的构建及其在 工程菌中的表达；
[0025] E、重组工程菌发酵放大，培养制得大量抗霉菌毒素单抗Ig的菌体液；
[0026] F、发酵培养结束后，用管式连续流式离心机或其他离心机对菌体液上清液进行离 心，从上清液中离心收集表达有抗霉菌毒素单抗Ig的菌体，分装后于20°C以下保存；
[0027] G、对抗霉菌毒素单抗Ig和由多种抗霉菌毒素单抗Ig复合组成的复合单抗IgC进 行菌体破碎，然后收集抗霉菌毒素单抗Ig和复合单抗IgC之可溶性抗体蛋白的上清和包含 体，得到高纯度的抗体。
[0028] 本发明所述的制备方法，其中，所述步骤A中，所筛选的霉菌毒素包括：黄曲霉毒 AFB1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素A、桔青霉素、伏马毒素B1、青霉酸和T-2毒素中 的一种或多种；
[0029] 所述步骤C中，杂交瘤细胞对应包括：黄曲霉毒素杂交瘤细胞、玉米赤霉烯酮杂交 瘤细胞、呕吐毒素杂交瘤细胞、赭曲霉毒素杂交瘤细胞、桔青霉素杂交瘤细胞、伏马毒素和 T-2毒素杂交瘤细胞中的一种或多种。
[0030] 本发明所述的制备方法，其中，所述步骤D中，抗霉菌毒素单抗Ig在工程菌中表达 具体包括：抗霉菌毒素单抗Ig在大肠杆菌中的表达和/或抗霉菌毒素单抗Ig在酵母菌中 的表达。
[0031] 本发明所述的制备方法，其中，所述步骤E中，重组工程菌发酵放大具体包括：重 组大肠杆菌发酵放大和/或重组酵母菌发酵放大；
[0032] 所述步骤G中，对抗霉菌毒素单抗Ig和由多种抗霉菌毒素单抗Ig复合组成的复 合单抗IgC进行菌体细胞破碎的方法包括：
[0033] 酶解-超声法破碎、高压匀浆破碎、化学渗透法、冻融法和单纯超声法。
[0034] 本发明所述的制备方法，其中，所述制备方法还包括步骤：
[0035] H、对制得的抗霉菌毒素单抗Ig和复合单抗IgC菌体和可溶性抗体蛋白进行纯化， 以用于食品和粮食中、以及用于预防和治疗畜禽和水产霉菌毒素中毒病，其中包括对菌体 液的纯化和干燥，以及对菌体破碎后的可溶性抗体蛋白的纯化和干燥；
[0036] I、将抗霉菌毒素单抗Ig菌体干粉或可溶性抗体蛋白干粉、或两种以上复合单抗 IgC菌体干粉或和可溶性抗体蛋白干粉纳米化。
[0037] 本发明还提供了一种抑灭霉菌毒素组合制剂，其中，包含前面所述的抑灭霉菌毒 素的基因工程重组高纯度抗霉菌毒素单抗和复合单抗制备方法所制备的抗霉菌毒素单抗 Ig或由多种抗霉菌毒素单抗Ig复合组成的复合单抗IgC。
[0038] 本发明所述的抑灭霉菌毒素组合制剂，其中，所述抗霉菌毒素单抗Ig或复合单抗 IgC为液体、干粉、纳米脂质体粉或高纯度可溶性抗体蛋白的液体、干粉、纳米脂质体粉。
[0039] 本发明所述的抑灭霉菌毒素组合制剂，其中，
[0040] 所述抑灭霉菌毒素组合制剂还包括辅料或基料，利用所述抗霉菌毒素单抗Ig或 复合单抗IgC以含0. 001 %以上抗霉菌毒素单抗Ig或复合单抗IgC的任意比例与辅料或基 料制成各种片剂、泡腾片、丸剂、胶囊剂、喷雾剂、粉剂、纳米微囊液、口服液剂、果涑或胶囊 和微胶囊；
[0041] 或者，利用所述抗霉菌毒素单抗Ig或复合单抗IgC以含0. 001 %以上抗霉菌毒素 单抗Ig或复合单抗IgC的任意比例与辅料或基料制成注射用粉针剂和水针剂；
[0042] 或者，所述抑灭霉菌毒素组合制剂还包括化学药品和中药复方成份。
[0043] 本发明所述的抑灭霉菌毒素组合制剂，其中，所述组合制剂包括赋形剂、填充剂、 溶剂、助溶剂、表面活性剂和胶囊辅料中一种或多种，胶囊辅料包括软胶囊和硬胶囊辅料。
[0044] 本发明所述的抑灭霉菌毒素组合制剂，其中，所述抗霉菌毒素单抗Ig或复合单抗 IgC以含0. 001 %以上抗霉菌毒素单抗Ig或复合单抗IgC的任意比例与与玉米蛋白粉或小 麦粉或氨基酸粉或工业葡萄糖等载体成份或辅料或溶剂，制成粮食抗霉剂或各种畜禽用及 水生动物用饲料抗霉剂或者饲料、饲料添加剂和预配料以及饮水剂和水产浸浴液、水塘拨 撒水剂。
[0045] 本发明的目标是找到一个既简单又可以反复简便操作、无限循环复制的有机形 式，以满足市场对抑灭霉菌毒素的巨大需求。
[0046] 本发明提供了一种可特异性直接中和及抑制霉菌毒素的单抗和复合单抗，并且以 基因工程菌发酵的方法制备这种抗霉菌毒素单抗和复合单抗。具体方案是：第一、采用基因 工程技术制备抗霉菌毒素单抗；第二、革除半个多世纪以来一直沿用的依赖动物制备多克 隆抗体的繁琐工艺，同时，摒弃克隆多抗的传统思路；而采用基因工程菌发酵扩增的方式大 规模復制多种单抗Ig，然后复合成多克隆抗体；本发明将这种复合Ig命名为IgC(C是"复 合"英文Compoud的第一个字母）。
[0047] 本发明的方案，将逐只鸡或逐头动物免疫注射然后从卵黄或血液中提取多抗的传 统工艺，改变为以发酵罐发酵的形式大规模生产大批量多抗。传统制备抗体有单抗和多抗 之分，单抗的特异性强，纯度高，重复性好，免疫效果比多抗好；但其制备过程繁琐，缺乏简 便性和易操作性。本发明扬长避短，结合了单抗特异性强、纯度高、重复性好、免疫效果的优 点，在制得相对应优质单抗的基础上，采用基因技术克隆工程菌，然后通过大量复制的方式 大规模扩增生产所需要的抗体，最后将以简便方式大量复制的、克隆了单抗的廉价菌体任 意组合成复合Ig即IgC。简言之，只要制备并储存了各种"种子液"，就可以随时采用十分 简便快捷的方法大规模生产具备单抗优势和多抗功能的IgC以满足需求。这种采用单抗菌 体任意组合成复合Ig即IgC的方