一种产低温酸性α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌及其基因工程菌的构建的制作方法

文档序号:8375867阅读:816来源:国知局
一种产低温酸性α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌及其基因工程菌的构建的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及低温酸性α -淀粉酶基因克隆及基因工程菌构建,属生物技术领域。
【背景技术】
[0002]我国是一个农业大国,淀粉资源非常丰富,淀粉深加工是农副产品升值的重要途径。目前,几乎所有淀粉深加工的基础都是从淀粉质原料的水解开始。淀粉水解过程大多经过液化和糖化两个阶段,而现有工业用淀粉酶品种单一,国内外市场中常用的淀粉酶主要是中温和高温α -淀粉酶,其适用pH值多为6?7,在酸性条件下酶活力明显降低,不能满足淀粉原料加工工艺的要求。酸性α-淀粉酶具有在酸性环境下表现活性,使淀粉质原料可以直接进行液化糖化过程,能缩短生产周期,降低生产成本,具有很好的经济和社会效.、
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[0003]在食品行业,低温α-淀粉酶作为一种安全、高效的改良剂,多用于面制品烘焙行业。如馒头生产中,将低温酸性淀粉酶添加面粉中,能明显提高酵母发酵活力,使面团发酵时间缩短。在面包制作中使用,可使面包烘焙后松软度好,色泽稳定,甜香味和口感都较理本巨
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[0004]自黑曲霉{Aspergillus niger)首先被发现可用于生产耐酸性α -淀粉酶后,人们相继发现多种微生物如白曲霉、青霉、酵母菌等也可产生低温酸性α-淀粉酶,但存在主要问题是大部分菌株产酶活力不高,缺乏可靠的安全性,不适宜进行工业化生产。为此,国内外研究人员进行了多方面的尝试,但到目前还未获得突破性进展,生产中使用的发酵菌株多为活性较低的曲霉。
[0005]近年来,我国烘焙行业发展较快,对低温酸性淀粉酶的需求不断增多,而目前,我国低温酸性淀粉酶生产能力滞后,表现在生产菌株单一、工艺传统、发酵产率较低,部分产品酶应用效果不理想。因此,开发低温酸性淀粉酶生产新品种,对弥补我国现有淀粉酶生产品种少、竞争力弱具有重要意义。对食品烘焙行业来讲,节约了成本、降低劳动强度、提高生产效益,具有非常好的经济效益。

【发明内容】

[0006]本发明之目的是针对实际生产中存在的生产菌株老化,发酵产率低下等不足之处而提供一种产低温酸性α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌及其基因工程菌的构建。
[0007]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
一种产低温酸性α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌,该菌株为枯草芽孢杆菌■sMiiJisMwsd-xm-l,该菌株于2013年10月30日保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:湖北省武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC N0.M2013517。
[0008]由上述述枯草芽孢杆菌构建含低温酸性α -淀粉酶的基因工程菌的方法,是以枯草芽孢杆菌dwsd-xm-Ι为材料,采用生物技术手段克隆了其基因组中的低温酸性α-淀粉酶基因,构建了该基因的真核表达载体,将该载体转化至毕赤酵母中,获得高产低温酸性α-淀粉酶的基因工程菌株。具体构建步骤如下:
(1)低温酸性α-淀粉酶基因片段的获得:设计两条特异性引物SPl和SP2,序列分别为:SP1:5' CA GAA TTC ATG TTT GCA AAA CGA TTC ;SP2:5,AA GCG GCC GCT CAT TGA AAGAAT GAG T。用SPl和SP2引物对枯草芽孢杆菌dwsd-xm-Ι中的低温酸性α -淀粉酶基因组进行PCR扩增,获得长约1452bp的基因片段,将之命名为As-Amy ;
(2)低温酸性α-淀粉酶基因片段及质粒pPIC9K的酶切处理:采用EcoR I和NotI限制性内切酶分别对PCR扩增得到的As-Amy基因片段和质粒pPIC9K进行酶切,然后对经酶切的As-Amy基因片段及质粒pPIC9K分别进行回收;
(3)重组表达载体pPIC9K/As-Amy的构建:将酶切回收的As-Amy基因片段和质粒PPIC9K按3:1的摩尔比混合,并添加DNA连接酶及相应缓冲液;在连接酶作用下,As-Amy基因片段和质粒PPIC9K在酶切位点粘性末端进行连接,形成重组表达载体,命名为PPIC9K/As-Amy ;
(4)重组表达载体pPIC9K/As-Amy的转化:毕赤酵母GS115感受态细胞的制备、转化参照Invitrogen公司毕赤酵母操作手册进行。
[0009](5)阳性转化子的筛选及鉴定:将转化后的毕赤酵母涂布d在YPD平板上,分别挑取若干转化子点接至含有0.5%可溶性淀粉的MM平板上。加适量甲醇诱导,在上述平板上的部分菌落的周围出现明显的透明水解圈。
[0010]将周围产生水解圈的菌落挑取,接种于YPD液体培养基中,30°C培养I?2d,提取菌体基因组DNA,以该DNA为模板,按步骤(I)的PCR反应体系及反应条件进行扩增,经PCR扩增后获得一条长约1500bp的DNA片段(见附图2),并将该DNA片段送到上海生工生物工程公司进行序列测定(见序列表),并与原基因片段进行比较。经鉴定,获得的转化子具有产生淀粉酶的能力,且基因组已转化进了 As-Amy基因,将该转化子命名为hgdsd-334,该转化子即为含低温酸性α-淀粉酶的基因工程菌。该含低温酸性α-淀粉酶的基因工程菌hgdsd-334已于2013年10月30日保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:湖北省武汉市中国典型培养物保藏中心,具体命名:巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)hgdsd_334,保藏编号为 CCTCC N0.M2013520。
[0011]所述低温酸性α-淀粉酶基因片段,其完整的读框包含1434个碱基,共编码477个氨基酸,编码的酶蛋白分子量为60Ku。
[0012]本发明的有益效果在于:从枯草芽孢杆菌dwsd-xm-Ι中克隆得到一个低温酸性α-淀粉酶基因,构建了该基因的真核表达载体,将该载体转化至毕赤酵母中,获得高产低温酸性α-淀粉酶的基因工程菌株。通过对该工程菌表达分析,该酶基因能够在菌体内顺畅表达并可分泌到胞外,具有较好的生产应用价值。
【附图说明】
[0013]图1.转化子在YPD平板上形成的透明圈。
[0014]图2.重组载体 pPIC9K/As_Amy 的 PCR 鉴定。
[0015]图3.菌株hgdsd-334发酵产酶及菌体生长曲线。
[0016]图4.菌株hgdsd-334发酵产酶对温度的稳定性。
[0017]图5.菌株hgdsd-334发酵产酶对pH的稳定性。
【具体实施方式】
[0018]本发明以下将结合实施例作进一步描述:
(I)低温酸性α -淀粉酶基因片段的克隆:根据枯草芽孢杆菌dwsd-xm-Ι中酸性淀粉酶基因序列,设计两条引物,分别为:SP1:5' CA GAA TTC ATG TTT GCA AAA CGA TTC ;SP2:5’AA GCG GCC GCT CAT TGA AAG AAT GAG T。其中,SPl 引物含 EcoR I 限制性酶切位点,而SP2引物含NotI限制性酶切位点,使之与质粒pPIC9K多克隆位点匹配。
[0019]用枯草芽孢杆菌dwsd-xm-Ι的基因组DNA为模板,按下述PCR反应体系和条件进行As-Amy基因片段的PCR扩增。PCR反应体系:DNA模板1.0 μ L,1XPCR缓冲溶液5 μ L,25mmol.171 的 Mg2+ 4 μ L,SPl 和 SP2 引物(20 μ mo 1.171)各 2 μ L,25mmol.171 dNTPs0.5 μ L,Taq酶(5U.μ L_0 0.5 μ L,加水到总体积50 μ L。PCR程序:95 °C预变性4 min ;94 V变
45s, 55 °C退火 40s,72°C延伸 lmin,30 个循环;72°C 延伸 10min,4°C保存。PCR 产物用Vitagene公司的DNA凝胶回收试剂盒回收。
[0020](2) As-Amy基因片段及质粒pPIC9K的酶切处理:将pPIC9K空载体及凝胶回收的As-Amy基因片段分别置于两个1.5mL的Eppendorf离心管中进
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