产生物乳化剂的嗜热地芽孢杆菌及其在高凝油开采中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物化工和能源开采技术领域，具体来说，涉及到一种高产生物乳化 剂的基因工程菌及其在高凝油开采中的应用。
【背景技术】
[0002] 生物表面活性剂是一类由动物、植物、微生物产生，具有疏水基团和亲水基团的两 亲性物质。生物表面活性剂按照分子量的大小可以分为两类：一类是低分子量的表面活性 剂，如糖脂、磷脂、脂肪酸、短链肽等，它们的活性作用主要是降低油-水的界面张力；另一 类多为生物大分子，又称为乳化剂，它们一般不会使油水界面张力降的很低，但对油-水界 面具有很强的亲和力，能吸附在分散的油滴表面，防止油滴聚集，从而使这种乳状液稳定。 目前研宄较多的乳化剂主要有Emulsan、Liposan、Alasan。
[0003] 随着人们环保和可持续发展意识的增强，相对于化学合成的表面活性剂，由活细 胞产生的自然表面活性剂受到了越来越多的关注。在自然表面活性剂中，这些由微生物产 生的表活剂表面活性高，具有很好的亲水亲油性能，较为适合工业化大规模生产。由各类微 生物产生的生物表活剂具有结构多样性、可降解性、低毒、耐高温等优良特性，使其在工业、 农业、纺织行业、医疗各领域都有广泛的应用。
[0004] 近年来，常温菌株生产表活剂的研宄越来越多，例如关于生产鼠李糖脂的菌株生 产温度均在30-37°C，而对于嗜热菌产表活剂的探索却相对匮乏，但是嗜热菌株产表活剂的 优势不容忽视。由于他们的生长环境需要高温条件，使得生产乳化剂的过程有着更快的反 应速度，可以降低发酵液的粘度便于菌种呼吸，降低污染杂菌的危险等。
[0005] 南开大学的专利200710056753. 4公开了一株嗜热地芽孢杆菌DM-2及其对重质烷 烃的降解效果和乳化原油效果；专利200710061323. 1公开了菌株DM-2生产生物乳化剂的 方法及其应用，相比这两个专利公开的菌株DM-2,其乳化剂产量低，仅为0. 4-0. 6g/L，从一 定意义上制约了其使用效果和成本，所以利用基因工程改造的方法提高生物乳化剂的产量 和菌株的乳化效果具有重要的意义。此外，利用廉价碳源进行生物乳化剂的发酵以进一步 降低生物乳化剂的成本也具有很高的应用价值。
[0006] 高凝油是一种特种油资源，具有凝固点高（>40°C)、含蜡高（>36% )的特点，且 胶质和沥青质的含量也比较高（最高可达13% )。凝固点和含蜡量呈一定的相关性，T= 30. 879+0. 508f(T=凝固点，°C;f=含蜡量，％ )。高凝油的这些特性使得它具有独特 的流变性表征：1、当所处环境的温度在析蜡点以上时，高凝油处于溶解状态，其流动性与一 般原油一致；2、当所处温度降到析蜡点温度以下反常点温度以上时，就会有分子聚集现象 的发生，并伴有蜡晶析出，高凝油呈悬浮状，近似流体；3、当所处温度继续下降到反常点温 度以下时，蜡晶析出量会增多，此时高凝油为假塑性流体；4、当所处温度下降到凝固点以下 时，此时液态烃就会失去流动性，成为塑性流体。
[0007]高凝油油藏在世界分布较广，中国是高凝油资源最为丰富的国家之一，已知中国 高凝油资源量可达50X108吨以上，占世界高凝油资源的30~40%，其中辽河盆地的资源 最为丰富。从目前高凝油油藏开发效果看，存在着诸多的问题：含水上升较快，析蜡温度较 高（接近地层温度），采出程度不高，原油地层粘度低，水驱效率较低，热采成本较高等。针 对高凝原油油藏地质特点和油藏流体特性，传统的采油方式主要原理是动力加热开采，使 高凝油不能达到它的凝固点，从而以液体形式开采，以期降低开采难度。但这种技术也存在 一定缺陷或制约，有些开采技术的成本相对较高，经济效益从而受损，如水利活塞泵采油技 术，它的井管复杂，成本高，密封度很难达标，限制了发展。目前，除了热采技术外，微生物采 油技术是高凝油开采经济上可行的三采技术之一，但是开采效果不稳定，急需进一步深入 研宄，找出稳定的菌种体系和开采方案。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种高产生物乳化剂的嗜热脂肪地芽孢杆菌基因工程菌和 该菌株的发酵液在高凝油开采中的应用。
[0009] 本发明提供的嗜热地芽孢杆菌A-2,该菌种已于2014年12月10日保藏在"中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心"（北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏 号为CGMCCNo. 10151，建议分类命名：嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillussp.)。
[0010] 本发明提供的嗜热地芽孢杆菌A-2,是利用芽孢杆菌表达载体pUCG18,将嗜热地 芽孢杆菌DM-2 (见2007100567534号专利）的糖基转移酶orf05703在自身多拷贝表达而 制成的基因工程菌。
[0011] 本发明同时提供了一种生物乳化剂，该生物乳化剂是一种糖蛋白类生物乳化剂， 由菌株A-2在45-70°C条件下利用葡萄糖、乙酸钠、乙醇、十六烷或橄榄油这5种不同类型的 碳源中的一种发酵产生，产量可达3-4g/L。具体发酵条件如下：将保藏于甘油管中的菌株 A-2活化，涂布LB平板，60°C培养过夜。挑取单菌落，接种到5mL的LB试管，60°C，200rpm， 培养12h。再以1 %的接种量接种到LB三角瓶中作为种子液，培养至00_为0. 5-0. 8,即处 于对数期内，5%接种到产乳化剂的发酵培养基中，60°C，200rpm，培养48h。
[0012] 所述产乳化剂的发酵培养基配方以g/L计为：K2HP04?3H204.8 ;KH2P041. 5 ; (NH4) 2S041 ;柠檬酸三钠0? 5 ;MgS04?7H20 0? 2 ;酵母提取物0? 1 ;CaCl2?2H20 0? 002 ; MnCl2 ? 4H200. 0004 ;NiCl2 ? 6H20 0? 0004 ;ZnS04 ? 7H20 0? 0004 ;FeCl3 ? 6H20 0? 0002 ; NaM〇04?2H20 0. 0002 ;蒸馏水1000ml，其中碳源为葡萄糖、乙酸钠、乙醇、十六烷或橄榄油5 类中的一种，各碳源的添加量分别为5g/L。
[0013] 所述生物乳化剂的组成按质量比计为72%多糖和28%蛋白，该生物乳化剂对正 己烷、柴油、二甲苯、十六烷、橄榄油和原油均有显著的乳化效果，乳化指数达到100%，是一 种耐高温、耐盐和耐酸碱的高效乳化剂。
[0014] 本发明提供的菌株A-2发酵液对高凝油有显著的乳化作用，能够将高凝油乳状液 的凝固点由42°C降低到4°C，粘度由57mPa?f降低到1. 3mPa?s、降粘率达到97. 72%， 降凝率达到90. 48%。
[0015] 本发明提供的菌株A-2发酵液（生物乳化剂）可应用于高凝油井的增产中，每口 油井注入菌株A-2的发酵液2-4吨和乳化剂发酵培养基90方，具体应用方法如下：
[0016] 方法一：反替菌株A-2的乳化剂发酵培养基15方，排量0.5方/分钟，关闭油管阀 门，注入2吨菌株A-2的发酵液，反挤菌株A-2的乳化剂发酵培养基75方，挤入排量0. 5方 /分钟，用15方清水顶替，顶替排量0. 5方/分钟，关井7天后开井生产。或者，
[0017] 方法二：反替菌株A-2的乳化剂发酵培养基15方，排量0.5方/分钟，关闭油管阀 门，注入2吨菌株A-2的发酵液，反挤菌株A-2的发酵培养基30方，挤入排量0. 5方/分钟， 用15方清水顶替，顶替排量0. 5方/分钟，关井7天，反替菌株A-2的发酵培养基15方，排 量0. 5方/分钟，再注入菌株A-2的发酵液2吨，排量1方/分钟，反挤菌株A-2的发酵培 养基30方，挤入排量0. 5方/分钟，关井7天后开井生产。其中A井生产时间为90天，与 注入微生物发酵液前1个月数据对比，每天增油0. 7吨，90天累计增油61. 6吨，产量基本稳 定；B井生产时间为90天，与