一种胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明公布了一种将胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的有效方法，属于再生医 学技术领域。
【背景技术】
[0002] 我国是肝病大国，每年因终末期肝病死亡者人数众多。目前，肝硬化、原发性肝癌、 代谢性肝病等终末期肝病的治疗主要依赖于原位肝移植，原位肝移植仍然是治疗终末期肝 病最有效的措施，但由于存在供肝严重短缺、免疫排斥和长期服用免疫抑制剂带来多种毒 副作用等缺点，其临床应用受到很大抑制。以肝细胞移植（Hepatocytetransplantation, HT)作为原位肝移植的替代治疗是一种可用于治疗肝脏疾病的可行方案，但亦面临着肝细 胞资源缺乏、体外培养的肝细胞增殖能力差等缺点限制了其应用。干细胞的研究为解决上 述问题提供了新的思路。
[0003] 胚胎干细胞（embryonicstemcells,ESCs)因其具有无限的增殖能力和分化为 各个胚层细胞的潜能，是细胞替代治疗临床疾病理想的种源细胞。特别是ESCs分化为肝 细胞样细胞（hepatocyte-likecells,HLCs)的研究，可为临床细胞替代治疗提供合适的 细胞来源，亦在药物评估和肝脏发生等基础研究方面起重要作用。目前国内外已报道了人 (Caietal, 2007;Lavonetal, 2004)和小鼠（Gouon-evansetal, 2006;Hamazaki etal，2001)ESCs体外分化为肝细胞或肝样细胞的研究，这些分化的细胞在形态上与成 体肝细胞相似，并表达肝细胞相关的基因和蛋白，有些分化得到的细胞还具备肝细胞的功 能，这些研究为以ESCs为种源细胞进行肝细胞替代治疗研究奠定了良好的基础。
[0004] 近年来，ESCs的诱导分化已形成了多种方法和技术体系，其中以分化过程可分为： 1.胚胎干细胞自发分化；2.胚胎干细胞直接以诱导剂诱导期分化；3.胚胎干细胞先形成拟 胚体（EB)，之后将一个球形EB直接接种，再添加各种诱导剂来诱导分化。在他们的研究中， 主要通过4个阶段的诱导实现ES细胞向功能性肝细胞的分化，即内胚层的诱导分化、肝特 异性细胞的诱导分化、成肝细胞的扩增和肝细胞的成熟。在这一过程中，每个阶段所要依靠 的细胞因子各不相同，常用的早期诱导因子有激活素A、丁酸钠SB等。激活素A可通过激 活activin/nodal信号通路诱导ESCs向内胚层分化。常用的中期诱导因子有HGF、FGF、 BMP、DMS0等。HGF可通过激活c-Jun通路促进肝脏发育。FGF家族中与肝脏发育相关的 主要因子有？6?2、？6?4、？6?7，来源于横隔间充质的81^2和81^4可与？6?联合诱导肝脏分 化。晚期促成熟因子主要包括0SM和地塞米松，前者通过gpl30信号转导通路诱导肝脏成 熟，后者参与肝脏糖异生。
[0005] 人类ESCs可以自发形成拟胚体，然后自发分化为各种组织特异性细胞系，其中 10~30%分化成肝细胞和肝细胞样细胞；通过富集拟胚体的内胚层，分化成肝细胞和肝细胞 样细胞的效率增长到50~65% ;而目前在iPSC和ESC分化成肝细胞的过程中，持续添加各种 组织特异性生长因子，其分化效率可达60~80%，诱导过程所需时间太长，需要20天左右；而 缩短诱导时间，诱导效率则明显下降。早期诱导因子丁酸钠是一种细胞周期阻抑化合物(组 蛋白脱乙酰化酶抑制剂)，在诱导过程中会使细胞大量死亡，需要大量的hESCs才能诱导出 少量的肝细胞。目前，诱导成功的肝细胞尽管满足了某些实验的需求，但是，对于临床要求 来讲，还具有较大的距离。所以，如何在此基础上进一步优化，也是近年来研究人员一直在 探讨的问题。
[0006] 氧是细胞生存的必要条件之一，也是细胞生物学行为和生理功能的一种重要调节 因子。细胞在体外培养下的生存和生长也必须有适宜的氧浓度，细胞培养本身又是研究氧 生物学作用的重要方法。然而，多种细胞体外培养所需的最适氧浓度还不确定，不同氧浓 度对细胞的作用及其机制尚不完全清楚。细胞的类型和机能状态、技术条件等因素都可 影响细胞对氧浓度变化的反应。人和哺乳动物细胞体外培养的气相环境条件一般是恒温 37°C，含5%~10%C02及饱和水蒸汽的空气。在细胞培养实验领域，人们普遍将标准C02 培养箱内空气的〇2体积分数作为细胞培养气相环境的正常或常规氧体积分数，简称常氧（ normoxia)，低于和高于常氧的氧浓度分别称为低氧（hypoxia)和高氧（hyperoxia)。在 胚胎发育早期，由于宫腔内血管尚未生长进入，所有的胚胎细胞处于低氧浓度的生理微环 境（宫腔内氧含量为2%~5%)。低氧作为一种生理性的刺激因素，影响着胚胎干细胞的生 长、分化。目前，对ESCs的体外分化研究多在常氧(约20%)条件下进行，难以反映体内的真 实情况。
[0007] 所以，针对上述技术背景和技术存在的问题，本发明拟在经典分化方法的基础上， 在细胞分化过程中，对细胞因子种类和作用模式进行优化，探索可以高效定向诱导胚胎干 细胞分化为成熟功能性肝细胞的方法，从而为研究肝细胞的发生发育和药物筛选建立一种 新的体外模型，同时也为胚胎干细胞在临床肝脏疾病的治疗应用方面提供一定的理论基础 和技术支持。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种高效的诱导胚胎干细胞分化为肝细胞的优化方法，大大 缩短了整个诱导分化所需的时间，且提高分化率。本发明是模拟宫腔内生理微环境，用低 氧条件（4% 02)预培养细胞，并运用P53联合Wnt5a作为前期诱导剂，联合肝细胞营养因子 aFGF、HGF、KGF、AFP等，通过类胚体EB途径实现的。
[0009] 为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过如下技术方案来实现 的： 一种胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，包括以下步骤： 步骤1)胚胎干细胞的体外培养，培养体系为含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基，其中 添加 0.1mmol/L2-巯基乙醇，25mMHEPES，100U/ml青霉素和 100ug/ml链霉素，1000 U/mL重组小鼠白血病抑制因子（LIF)，培养条件为常氧、5%C02、37°C; 步骤2)拟胚体的形成：培养体系为去除胚胎干细胞培养体系中的LIF，同时将胎牛血 清浓度调整为15%即可；将胚胎干细胞以3X104~5X104/ml浓度接种于未经过促细胞黏 附作用处理、瓶底光滑的玻璃培养瓶中摇动培养法，1天后便会有大量的拟胚体生成，形成 成熟拟胚体；将成熟的囊性拟胚体用胰蛋白酶消化为单个细胞，培养条件为常氧、5%C02、 37。。； 步骤3)诱导分化阶段I:培养体系为诱导培养培养体系I，培养条件为低氧4% 02、5% C02、37°C，培养时间为2天； 步骤4)诱导分化阶段II:培养体系为诱导培养培养体系II，培养条件为常氧、5%C02、 37°C，培养时间为3天； 步骤5)诱导分化阶段III:培养体系为诱导培养培养体系III，培养条件为常氧、5%C02、 37°C，培养时间为3天； 步骤6)诱导分化阶段IV:培养体系为诱导培养培养体系IV，培养条件为常氧、5%C02、 37°C，培养时间为2天。
[0010] 进一步的，所述的步骤3)中的诱导培养培养体系I为将胎牛血清浓度调整为10% 的拟胚体形成阶段培养体系，并加入肿瘤抑制因子P53和肿瘤抑制因子Wnt5a制备而成。
[0011] 进一步的，所述的步骤4)中的诱导培养培养体系II为将胎牛血清浓度调整为10% 的拟胚体形成阶段培养体系，并加入20ng/ml甲胎蛋白（AFP)，100ng/ml酸性纤维细胞生长 因子（aFGF)，30ng/ml人成纤维细胞生长因子4 (FGF4)制备而成。
[0012] 进一步的，所述的步骤5)中的诱导培养培养体系III为将胎牛血清浓度调整为 10%的拟胚体形成阶段培养体系，并加入20ng/ml肝细胞生长因子（HGF)，10ng/ml制瘤素 (OSM)，20ng/ml角质细胞生长因子（KGF)制备而成。
[0013] 进一步的，所述的步骤6)中的诱导培养培养体系IV为将胎牛血清浓度调整为10% 的拟胚体形成阶段培养体系，并加入1(T7M地塞米松（DEX)，0. 8%二甲基亚砜（DMSO)，5ug/ml 胰岛素，5ug/ml转铁蛋白制备而成。
[0014] 进一步的，所述的诱导培养培养体系I中的肿瘤抑制因子P53的浓度范围是 0. 5-lU/ml，优选0. 16U/ml;肿瘤抑制因子Wnt5a浓度范围是50-200ng/ml，优选100ng/ml。
[0015] 本发明的主要优点在于： (1)本发明将成熟EB经消化成为单细胞后接种进行诱导培养，让细胞与因子和胞外基 质能够充分接触，从而能有效地以及快捷地诱导出肝细胞。
[0016] (2)本发明运用低氧条件（4% 02)预培养细胞，模拟宫腔内生理微环境，促进ES细 胞向肝细胞的分化，肝细胞相关基因的表达提高20%，使分化细胞更接近于真正的肝细胞。
[0017] (3)本发明首次运用P53联合Wnt5a作为前期诱导剂，避免诱导剂对干细胞本身的 伤害，加速胚胎干细胞向内胚层的分化。同时，细胞诱导中后期培养系统中选择了采用促进 肝细胞发生及生长的细胞生长因子TGF、aFGF、HGF、KGF、AFP、胰岛素等。细胞生长因子得 到更合理优化，大幅度的提高肝细胞分化率，肝细胞分化率为95%。
[0018] (4)本发明方法大大缩短了胚胎干细胞体外诱导分化为肝细胞的时间，整个分化 过程仅需13天。
[0019] (5)本发明方法条件易于控制，分化过程中便于形态观察，操作简单，成本低廉。
【附图说明】
[0020] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中： 图1是本发明一种胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法的实验流程图； 图2是本发明具体实施例中EB细胞在分化过程中的形态学变化结果（X100)。其中图2A、图2C、图2E为低氧预培养组细胞在分化第1、3、9天的细胞形态；图2B、图2D、图2F为 常氧对照组细胞在分化第1、3、9天的细胞形态； 图3是本发明具体实施例中诱导第2、4、7、10天的两组分化细胞的RT-PCR检测结果； 图4是本发明具体实施例中RealtimePCR分析肝细胞相关基因AFP、ALB、CK18在分 化过程的变化； 图5是本发明具体实施例中免疫荧光化学染色结果（X200); 图6是本发明具体实施例中诱导肝细胞糖原染色结果（X100); 图7是本发明具体实施例中诱导肝细胞的ICG代谢能力评价结果（X100)，其中图7A为导肝细胞吸收ICG的结果；图7B为诱导肝细胞释放ICG的结果。
【具体实施方式】
[0021] 以下将结合附图，参照具体实施例详细描述本发明，如图1所示的本发明一种胚 胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法的实验流程图，本发明可以按如下所述来选择细胞 诱导培养所需试剂及器材： 1.ES细胞：选用的人源HIES细胞购自美国WiCell研究所； 2. 细胞培养试剂： ES细胞培养基：DMEM(glucose，4.5g/L)，20%胎牛血清，0?lmmol/L2-巯基