一种细胞培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种新的细胞培养方法，适用于各种细胞，特别适 用于对培养条件敏感的干细胞。本发明涉及一种动静态交替的细胞培养方法，在细胞培养 过程中，在同一个培养容器进行的细胞培养至少包括静态培养的过程、载体运动的过程、培 养容器两端对调的过程和细胞分布的过程。在同一细胞培养容器中构建了一种动静态交替 培养的理想反应器，可以尽可能减小剪切力，避免细胞生长时聚集成团，在培养时使细胞均 匀分布，并进一步避免载体在培养容器对调过程中产生横向移动，为细胞培养提供一个理 想的生长代谢的环境。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着生物技术的发展，细胞治疗的技术越来越受到广泛应用，陆续有多种 细胞制剂获得各国食品药品监管部门批准上市。2010年美国FDA批准细胞免疫治疗晚期前 列腺癌制剂Provenge上市，2011年美国FDA批准Laviv成纤维细胞治疗鼻唇沟和脐带血干 细胞产品HEMAC0RD，期间韩国KFDA也陆续批准多个间充质干细胞产品，预示细胞个体化治 疗的新时代到来。如此情形下，迫切需要大规模培养患者自体细胞，以便获得大量有用的细 胞或细胞表达产物。传统的玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，早已不能满足所需细胞数量 及其分泌产物。至今，已经发展出多种类生物反应器，滚瓶式生物反应器、搅动悬浮培养生 物反应器、摇袋式生物反应器、旋转壁式生物反应器、平板型生物反应器、固定流化床式生 物反应器。
[0003] 动物细胞的大规模培养需要特殊的生物反应器，与微生物和植物细胞不同，动物 细胞的外层是质膜，许多种类的细胞，特别是造血干细胞和免疫细胞，在培养时对剪切力十 分敏感。比如，剪切力可以在干细胞培养中产生非特异性分化，细胞凋亡增加，极大地降低 干细胞扩增和定向分化的效率。较高的剪切力还可能在蛋白表达中释放出更多的非特异性 蛋白，需要的特异性蛋白在培养中比例减小，蛋白纯化难度大大增加。静置培养的剪切力虽 然最小，但静置培养的细胞通常在培养容器的底部，那么如果细胞聚集成团，一些细胞无法 获得足够的营养，因此不适合用于大规模的细胞扩增。一些生物反应器虽然能够降低剪切 力，但是，这些生物反应器，必须通过不断地运动、搅拌和/或搅动细胞使细胞保持悬浮。一 旦生物反应器停止运转，细胞将累积在底部某个位置或者培养容器的某个部位，而且是不 均匀地分布，不利于绝大多数细胞生长，至少不利于细胞有效增长。因此，即使这样的生物 反应器作了减少剪切力处理，但是当生物反应器运转时，仍有剪切力连续作用于培养的细 胞上。在我们当前的发明中，当生物反应器处于静置状态时，细胞可以均匀地分布于培养室 的底部或载体的表面。无疑，一个间歇性的搅拌，或者适当的动静态交替培养，不仅会是剪 切力最小化，而且能为细胞提供一个理性的代谢环境。然而因为运动的细胞的惯性作用，在 动静态交替培养细胞时通常也很难使细胞均匀分布。当细胞分布不均匀时（例如细胞局部 堆积或者聚集）将对细胞生长很有害。我们现在发明一种能使细胞均匀分布的动静态交替 生长的方法，以便动态和静态以及动静态交替都可以使用在目前公开的生物反应器上。
[0004] 本发明所述的ZXY生物反应器是仪器自动化培养，动态静态两个状态都在同一个 细胞培养容器中进行，在状态转变的过程中不需要转换培养容器，当细胞从动态转换成静 态时，细胞可以均匀分布在细胞培养容器的底部或者分布在搅拌材料的表面。而有些生物 反应器在动静转变时需要换容器。因此，我们的发明为细胞生长的悬浮状态以及静置状态 提供了最佳的状态，并且两种状态可以任意转换。
[0005] 许多培养的动物细胞都是贴壁依赖型细胞，所以大规模动物细胞培养中都使用微 载体、理想的微载体应有利于细胞的快速附着和扩展，有利于细胞高密度生长，不干涉代谢 产物合成和分泌。球形微载体因制造容易而普遍使用，近年来开始使用的多孔微载体可提 供大的表面积/体积比率和最大的细胞密度，多孔微载体的研制替代了容易使细胞受机械 搅拌与喷气损伤的常规载体，对于有些细胞株尽可能贴在微载体内，但移动性很差，因此需 要开发更好的培养方式，改善细胞的移动性。我们的发明中，细胞生长的空间在细胞吸附 的载体和载体构成的间隙中，随着细胞培养过程中细胞载体的运动，细胞所处的微环境随 之而改变。许多微载体处于运动的状态使细胞载体处于稳定的状态，比如采用NASA技术的 RWV生物反应器，反应容器处于不断的旋转过程，使载体悬浮在培养基中，假如旋转速度不 一致，载体的位置就会改变不受控制。在我们的专利中，优化了细胞培养过程中的参数，保 证在培养的动态以及静态过程中载体在固定位置不改变。
[0006] 传统的细胞培养是在培养瓶、培养皿或者培养板中细胞以一个静止的状态生长， 随着细胞的增长，培养容器中生长的空间随着细胞的扩增逐渐减少，细胞生长所需的C02、 〇2、pH，都无法满足所有细胞的生长，会造成不必要的损失。
[0007] 在先专利（专利申请号为201280001774. 5)中，介绍了一种细胞培养的生物反应 器，虽然能实现动静态交替培养，但在细胞生长过程中，存在载体和细胞往一侧聚集，导致 静态培养时细胞分布不均匀的现象；另外，该专利虽然通过采用较大的载体来避免细胞生 长聚集成团的问题，但是效果仍有待进一步改进。
[0008] 另外，培养容器中的载体以及载体之间的空隙构成细胞生长的微环境，载体的微 小移动会对载体之间空隙进行重新排列，使得细胞生长的微环境随之改变，另外，载体的细 微移动都会产生细胞运动，造成细胞挤压，造成细胞损伤。许多生物反应器在培养细胞时随 着细胞的增长，培养容器中的细胞密度逐渐增加，一般的细胞密度比较小时，细胞的生长就 会比较缓慢，随着细胞的增殖，培养密度逐渐增加，在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入 平顶期，然后退化衰亡。在我们的发明中，一般容器为立体的形状，可为多面体，如为长方 体，培养容器则有六个面，有三种不同大小的侧面，每个面都可以供细胞生长，在细胞接种 时，未开始扩增，细胞的培养密度比较低，程序控制载体和细胞生长时落在横截面积较小的 一面，相对的增加细胞的堆积密度，随着细胞的生长，较小的截面积上的细胞越长越多，细 胞密度太大时，细胞生长逐渐变缓慢，并且较大的细胞密度时周围培养基的养料无法及时 补充满足细胞增长，当细胞达到一定密度时，程序控制培养容器进行翻转，经过培养程序动 态对调后，进入静态培养过程，此时程序调节载体和细胞落在培养容器中横截面积更大的 一面，控制堆积的细胞密度在比较合适的生长范围内。本发明的细胞培养方法中，通过调节 细胞在不同的平面上生长，变换细胞生长时的增殖密度，使细胞始终在最优的环境中生长。
【发明内容】
[0009] 为了解决如何实现在同一个反应器中包含动静态两种状态；如何使动态培养结束 后细胞均匀分布；如何减少载体的横向位移，对细胞造成的聚集和损伤的问题；本发明提 供了一种细胞培养方法，能有效地解决现有技术存在的问题。
[0010] 本发明所述的细胞培养方法如图1、图2,是通过培养容器和载体的协同运动达到 细胞动静态交替运动的过程。一般的，细胞的生长在静态中进行，培养一段时间后，将细胞 进行重新分布，本发明中的静态和动态过程在同一个培养容器中进行，准确的说，在同一个 培养容器进行的细胞培养至少包括静态培养的过程、载体运动的过程、培养容器两端对调 的过程和细胞分布的过程；培养容器中具有载体；静态培养的过程中，载体分布于培养容 器的一端，细胞分布在载体的表面、载体之间的空隙中或培养容器的底部，与培养容器保持 相对静止；载体运动的过程中，载体由培养容器的一端向另一端运动；培养容器对调的过 程中，载体固定在培养容器的一端，培养容器的两端发生对调，载体以相对于培养容器静止 的方式，跟随培养容器对调；细胞分布的过程中，载体重新位于培养容器的一端，细胞由混 悬状态分布在载体的表面、载体之间的空隙或培养容器中。
[0011] 本发明提供新的细胞培养方法，该方法是一种动静态结合的细胞培养过程，本发 明所说的过程是在同一个培养容器进行的细胞培养至少包括静态培养的过程、载体运动的 过程、培养容器两端对调的过程和细胞分布的过程。本发明所述的动静态结合的细胞培养 方法是动态与静态交替进行，间歇的搅拌方式，可以使细胞生长的更好。在我们的发明中， 动静两态都在同一个细胞培养容器中进行，在状态转变的过程中不需要转换培养容器，当 细胞从动态转换成静态时，细胞可以均匀分布在细胞培养容器的一端或者吸附在搅拌材料 的表面。
[0012] 本发明所述的细胞培养方法，在动态结束达到的静态过程时，能使细胞均匀的分 布在细胞容器中或者吸附在载体的表面。
[0013] 本发明所述的静态过程，是细胞与培养容器的相对不运动状态。
[0014] 本发明所述的动态过程，包含载体在培养容器中的沉降或上浮和/或受到外力作 用在培养容器中移动并带动细胞移动使之悬浮的过程。在进行一段时间的静止培养后，根 据细胞增长速度和数量，决定动态的过程频率和持续时间。
[0015] 细胞均匀分布的实现，可以通过载体在培养容器中的搅拌，采用温和的移动。
[0016] 在我们的发明中，培养容器的每个侧面都可以供细胞生长，在细胞接种时，未开始 扩增，细胞的培养密度比较低，细胞和载体落在横截面积较小的一面，随着细胞的生长，较 小的截面积上堆积太多的细胞会妨碍细胞生长，这个情况下，经过培养程序动态对调后，自 动调节载体和细胞落在培养容器上横截面积比较大的侧面，控制细胞生长密度在比较合适 的范围内。
[0017] 在一个实例中，培养载体中包含可磁化材料，例如硅钢、Fe304或任何其它适合的材 料。可磁化材料意味着，载体（例如磁珠）在有磁场时有磁性，但一旦远离磁场，或者是磁 场离开载体附近，便不再有磁性。在这个实施例中，载体与培养容器的固定可以通过磁场控 制，根据载体的重力、在培养液中