杂交瘤细胞株McAb 1H2及兔出血症RHDVa型病毒单克隆抗体的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体。
【背景技术】
[0002]兔出血症(RabbitHemorrhagic Disease, RHD)，俗称“兔瘟”(Rabbit Plague)，是由兔出血症病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus, RHDV)引起的急性、烈性、接触性传染病，以肝坏死、实质脏器水肿、呼吸系统及全身多器官淤血及出血性变化为主要特征，对养兔业通常造成毁灭性的打击。
[0003]2013 年 Ghislaine Le Gall_Recul6 等人报道了有 RHDV2 型病毒的出现，RHDV 2型病毒与RHDVa型病毒核衣壳蛋白基因序列的同源性为82.4%，氨基酸序列的同源性为89.2%。这两株病毒的免疫交叉保护率为75%。VP60基因是病毒唯一的衣壳蛋白编码基因，在RHDVa型病毒中VP60基因的同源性在93.7%?99.8%之间；在RHDV2型病毒中VP60基因的同源性为98.5%。由于RHDV 2型病毒与RHDVa型病毒VP60蛋白氨基酸序列的同源性为89.2%，两者相似的抗原位点多。所以，目前还未有能够单独识别RHDV2型病毒或RHDVa型病毒的单克隆抗体。
【发明内容】
[0004]本发明是为了解决目前没有能够单独识别RHDV2型病毒或RHDVa型病毒的单克隆抗体的问题，而提供的杂交瘤细胞株McAb 1H2及兔出血症RHDVa型病毒单克隆抗体。
[0005]本发明杂交瘤细胞株McAb 1H2为小鼠杂交瘤细胞(Mus musculus Hybridoma)McAb 1H2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCN0.10317ο
[0006]本发明兔出血症RHDVa型病毒的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC N0.10317的杂交瘤细胞株McAb 1Η2产生。
[0007]本发明杂交瘤细胞株McAb 1Η2分泌的兔出血症RHDVa型病毒的单克隆抗体可以单独识别RHDVa型病毒和VP60a蛋白；该单克隆抗体分子重链为IgGl亚型，轻链为Kappa亚型(如图1所示)。
[0008]利用本发明兔出血症RHDVa型病毒的单克隆抗体可以准确的鉴别出患有兔出血症的兔子具体感染的是否为RHDVa型病毒，能够更有针对性的采取措施，对后期的免疫和防治具有深远的意义。
[0009]杂交瘤细胞株McAb 1H2为小鼠杂交瘤细胞McAb 1H2，属于小鼠属(Mus)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏号为CGMCC N0.10317，保藏日期为2015年I月21日。
【附图说明】
[0010]图1是杂交瘤细胞株McAb 1H2分泌的兔出血症RHDVa型病毒的单克隆抗体分子亚型鉴定结果图。
[0011]图2是杂交瘤细胞株McAb 1G2分泌的兔出血症RHDV2型病毒的单克隆抗体分子亚型鉴定结果图。
[0012]图3是杂交瘤细胞株McAb 1H2所分泌的抗体分子的ELISA鉴定结果图，图3中a为RHDVa病毒粒子；b为重组Bac_VP60a蛋白；c为重组Bac_VP602蛋白。
[0013]图4是杂交瘤细胞株McAb 1G2所分泌的抗体分子的ELISA鉴定结果图，图4中a为RHDVa病毒粒子；b为重组Bac_VP60a蛋白；c为重组Bac_VP602蛋白。
[0014]图5是杂交瘤细胞株McAb 1H2所分泌的抗体分子的Western blot鉴定结果图，图5中M为蛋白质分子量marker ；b为重组Bac_VP60a蛋白；c为重组Bac_VP602蛋白。
[0015]图6是杂交瘤细胞株McAb 1G2所分泌的抗体分子的Western blot鉴定结果图，图6中M为蛋白质分子量marker ;b为重组Bac_VP60a蛋白；c为重组Bac_VP602蛋白。
[0016]图7是杂交瘤细胞株McAb 1H2所分泌的抗体分子的IFA鉴定结果图，图7中b为rBacmid-VP60a 感染的 Sf9 细胞；c 为 rBacmid_VP602 感染的 Sf9 细胞。
[0017]图8是杂交瘤细胞株McAb 1G2所分泌的抗体分子的IFA鉴定结果图，图8中b为rBacmid-VP60a 感染的 Sf9 细胞；c 为 rBacmid_VP602 感染的 Sf9 细胞。
【具体实施方式】
[0018]本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的任意组合。
[0019]【具体实施方式】一:本实施方式杂交瘤细胞株McAb 1H2为小鼠杂交瘤细胞(Musmusculus Hybridoma)McAb 1H2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.10317，保藏日期为2015年I月21日。
[0020]【具体实施方式】二:本实施方式兔出血症RHDVa型病毒的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC N0.10317的杂交瘤细胞株McAb 1H2产生。
[0021]实施例1
[0022]1.1制备检测抗原
[0023]将RHDVa-VP60 基因(GenBank access1n number:JF412629)和 RHDV2-VP60 基因(GenBank access1n number:HE800532)分别克隆到 pFastBacHTa 载体中，获得重组质粒pfast_VP60a和pfast_VP602，转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞。接种到LB琼脂平板(含卡那霉素50mg/mL、庆大霉素40mg/mL、四环素50mg/mL、X_gal 50mg/mL和IPTG142.811^/1^)，37°0培养4811左右。挑取白色菌落，在LB琼脂平板(含卡那霉素50mg/mL、庆大霉素 40mg/mL、四环素 50mg/mL、X_gal 50mg/mL 和 IPTG 142.8mg/mL)上再次划线培养，菌落进一步确定为白色者接种于LB培养基(该LB培养基含卡那霉素50mg/mL、庆大霉素40mg/mL和四环素50mg/mL)，37°C摇震培养24?36h。提取Bacmid为模板，以通用引物M13(+)和M13(-)PCR扩增长度约为4.2kb的片段、以引物M13 (+)和VP60下游引物PCR扩增长度约为4.0kb的片段。选择扩增片段符合预期大小、特异性良好的重组Bacmid，命名为rBacmid-VP60a和 rBacmid_VP602o
[0024]用rBacmid_VP60a 和 rBacmid_VP602 感染 Sf9 (SpAoptera frugiperda)细胞，合成特异性的重组Bac-VP60a和Bac_VP602蛋白。并以重组Bac_VP60a和Bac_VP602蛋白作为单克隆抗体的检测抗原。
[0025]1.2单克隆抗体制备
[0026]1.2.1免疫小鼠实验
[0027]将纯化后的重组蛋白Bac_VP60a和重组蛋白Bac_VP602用无菌PBS培养基稀释至500 μ g/mL，加入等量的氟氏完全佐剂乳化后，选择6?8周龄BALB/c雌性小鼠腹腔及背部皮下多点注射，剂量0.4mL/只；第7d、21d分别进行第二次、第三次免疫，抗原用等量氟氏不完全佐剂乳化；第35d尾静脉注射无佐剂抗原80 μ g，三天后断尾采血测定血清ELISA效价，选取效价较高的小鼠无菌取脾脏进行融合。
[0028]1.2.2 SP2/0 细胞准备
[0029]融合前2周复苏SP2/0骨髓瘤细胞，进行传代培养，待细胞生长状态稳定后，将骨髓瘤细胞扩大培养，观察细胞生长状态，选择分布均匀、大小均一、生长旺盛的细胞进行融合。融合当天，用吸管吸取无血清DMEM培养基将细胞从瓶壁吹下，收集于离心管中，100r/min离心5min，弃上清，用无血清DMEM将骨髓瘤细胞悬浮，台盼蓝计数备用。
[0030]1.2.3饲养层细胞制备
[0031]将加强免疫后的BALB/c小鼠摘除眼球放血后断颈椎处死，浸泡于75%酒精消毒3?5min。用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜。用无菌注射器向腹腔内注入6?8mL无血清DMEM培养液，反复冲洗3?4次并吸出培养液，放入1mL离心管，1200r/min离心5?6min。含10%优级胎牛血清培养液混悬，调整细胞数IX 105个/mL后分装96孔板，100 μ L/孔，置含5% C02的37°C恒温细胞培养箱培养。一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5 X 106?8 X 106个腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5 X 106个/mL，小鼠脾细胞为I X 106个/mL,小鼠的成纤维细胞I X 105个/mL，均为100 μ L/孔。
[0032]1.2.4免疫脾细胞
[0033]脾细胞悬液的制备程序如下:取加强免疫后的BALB/c小鼠，摘除眼球采血分离血清后作为抗体检测的阳性对照。通过拉颈脱位致死小鼠，浸泡于75%酒精中消毒3?5min，于解剖台上固定后用无菌剪刀剪开腹部左侧皮肤，剪开腹膜，暴露脾脏。将脾脏用无菌剪刀取出后置于盛有1mL不完全培养基的平皿中，剪除周围结缔组织，轻轻洗涤，置200目铜网上用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的2倍，细胞数为2X10