用于病毒纯化用连续超速离心的糖溶液配方的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及病毒纯化领域。
【背景技术】
[0002] 病毒，无论是自然出现的还是其重组体，皆可用于疫苗接种和基因治疗领域。许 多病毒或类病毒粒子可以安全并有效地在寄主细胞中增殖。有数种公开出版物描述了从 寄主细胞中提纯病毒的技术，主要集中于特异性的层析基质的应用，用于由寄主细胞裂解 物纯化病毒（参见，例如，美国专利No. 6, 008, 036)。描述的其他方法，例如，在美国专利 No. 6, 048, 537中描述的方法使用了连续式蔗糖梯度离心，其提供的产品具有较小的抗原纯 度，并且要求进一步通过离心提纯的步骤。这些方法也还遭受抗原聚集之患，这可以导致病 毒抗原的损失，或者抑制病毒失活步骤。
[0003] 病毒聚集还可能会抑制层析工艺的产率，其时间和成本要求高，难以适合于大规 模生产。因此，本发明的目标在于提供一种纯化病毒、尤其是从寄主细胞样本中纯化病毒的 方法，其比较简单，但仍能以高纯度提供全病毒抗原组分，同时减少病毒抗原聚集。
【附图说明】
[0004] 图1 :用普通的超速离心工艺（图la)和本发明的超速离心工艺（图lb)纯化的 PMVHs的显微照片。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种用于提纯病毒或病毒抗原的方法，其包括：提供病毒制品并在糖 梯度中离心所述病毒制品，其中该糖梯度是由在缓冲水溶液中的浓度为蔗糖当量34%至 50% (w/w%)的第一糖层A和浓度为蔗糖当量50%至65% (w/w%)的第二糖层B所建立 的，缓冲水溶液中的一种缓冲剂成分是pKa值为6. 0~9. 4的缓冲剂成分；以及从离心液中 收集所述病毒或病毒抗原，即，离心方法的产物。
[0006] 本发明的一个方面在于提供一种提纯病毒或病毒抗原的方法。该方法涉及到提供 包含糖梯度的溶液，所述糖梯度是通过离心至少一种第一缓冲糖溶液和至少一种第二缓冲 糖溶液而建立的。在第一缓冲糖溶液中的糖浓度具有35%至50% (w/w%)的蔗糖当量； 在特定的实施方式中，蔗糖当量为34%至46% (w/w%)。在第二缓冲糖溶液中的糖浓度具 有50%至65% (w/w%)的蔗糖当量；在特定的实施方式中，蔗糖当量为50%至60% (w/ W%)。一旦建立起糖梯度，就将病毒制品加至该糖梯度。然后将病毒制品和糖梯度离心以 得到波峰汇集液（peakpool)，并且萃取波峰汇集液以得到病毒或病毒抗原。
【具体实施方式】
[0007] 在病毒或病毒抗原提纯期间，通过离心浓缩病毒或病毒抗原，从而使其与细胞培 养基成分和/或寄主细胞和寄主细胞成分相分离。本发明的方法能够在提纯的离心步骤中 使病毒聚集和病毒损失最小化。
[0008] 在本发明的方法中，通常将生理学缓冲液中的第一糖溶液垂直地加载入连续超速 离心装置，从而形成水平的糖溶液层A;然后将在相同或不同的生理学缓冲液中的更高浓 度的第二糖溶液加载入该装置，从而形成水平的糖溶液层B。然后启动该装置，形成糖梯度。 最大浓度在装置的外壁，并且浓度朝向装置的中心逐渐变小。然后将来自细胞培养物的包 含病毒的收获液加载入装置中，并且病毒颗粒会迀移到糖梯度中的位置，在该位置它们的 密度与梯度密度相等。当糖是蔗糖时，出现该平衡的典型密度范围是36% -48% (w/w% ) 蔗糖。一旦装置停止，该梯度会向水平位置移动，并且该包含病毒颗粒的梯度部分（或者 "波峰汇集液）"将从装置中被抽出。
[0009] 本发明的一个方面是一个令人惊奇的发现，与惯常的利用单一浓度蔗糖水溶液从 而形成蔗糖梯度的方法相比，其通过利用双层溶液的方法，能够增加波峰汇集液的体积。即 使使用蔗糖、并且梯度中的最大蔗糖浓度与在常规方法中使用的相同，也能得到这一令人 惊奇的效果。通过优化两个蔗糖溶液层A和B的浓度和含量，能够增加波峰汇集液体积，例 如，增加两倍。通过减小全病毒颗粒或抗原各自的浓度，该增加的波峰汇集液体积可减少它 们的聚集。
[0010] 连续超速离心工艺对于病毒制品的提纯是有用的。高浓度的糖（例如，蔗糖或山 梨糖醇）或者盐（例如CSCl2或NaBr)的溶液能够被用于通过超速离心法产生梯度。然而， 不含任何添加剂的糖溶液具有低浓度的电解质并且没有缓冲能力。因此，本发明的一个方 面是获得如下认识：糖溶液比如蔗糖溶液中的病毒制品，取决于病毒颗粒的浓度，其具有较 强的形成聚集体的倾向，这会在用于疫苗生产的进一步加工中造成问题。通过使用糖溶液 (例如，55%w/w的蔗糖溶液）外加生理学浓度的盐（例如，约4-8g/kg的NaCl)以及外加 缓冲液（例如，大约l〇-20mmol/kg的Tris，接着调节pH)、从而在梯度中获得生理学的电 解质以及pH条件，本发明的方法能够有效地使这些问题最小化。在特定的实施方式中，不 同的糖溶液被应用以在超速离心机中构造梯度。作为实施例，将200mL的55%w/w溶液和 800mL的42%w/w溶液加载至超速离心机。较小量的较高浓度的蔗糖溶液可确保在超速离 心的未尾，最大蔗糖浓度保持在高于45% ;并且大量的42%蔗糖可得到在约40%的范围内 更平缓的梯度，在该处会典型地出现病毒波峰最大值。通过本发明的这些方法，能够增加波 峰汇集液的体积，并且因此将病毒颗粒悬浮液稀释并导致较少的聚集。而且，通过使用这样 的蔗糖配方，分子或颗粒在加载至超速离心机的上清液与梯度之间的扩散被改进。
[0011] 举例来说，使用在20mmol/kgTris-缓冲液中大约42%和55%(w/w%)的蔗糖溶 液形成的密度梯度被发现对于流感病毒是特别有用，但还可以容易地适用于其他病毒。对 于pH为6. 5至9. 7的范围，Tris(三羟甲基氨基甲烷）是有用的缓冲剂。虽然在本发明的
【具体实施方式】中的这一特别的实施例中使用蔗糖，但可以使用适合于梯度离心的其他糖。 另外，可以使用其他的缓冲化合物、尤其是有机缓冲化合物比如胺类。优选缓冲液的pKa值 高于 6、6. 2、6. 4、6. 6、6. 8、7. 2、7. 4、7. 6、7. 8 或 8. 0,并且低于 9. 4、9. 2、9. 0、8. 8、8. 6、8. 4 或 8. 2。合适的缓冲剂包含例如HEPES(4-(2-羟乙基）-1_哌嗪乙烷磺酸）、ACES(N-(2-乙酰 胺基）_2_氨基乙烧横酸）、二_tris_甲烧或-丙烷、CAPS(N_环己基_3_氨基丙烷横酸） 或CAPSO、PIPES(哌嗪-N，N' -二（2-乙基磺酸））、磷酸盐缓冲剂、或者任何其他在生物化 学领域中使用的缓冲剂。该缓冲剂优选对于生物分子是化学惰性的。
[0012] 该离心方法能够产生波峰汇集液组分，其中在就电解质和pH条件而言的生理条 件下，病毒颗粒被分散。在波峰汇集液组分中全病毒抗原的浓度能够通过加入不同量的高 浓度和低浓度糖溶液而改变，以便限定梯度并因此限定波峰组分的体积。另外，通过单独添 加盐和合适的缓冲液（例如，Tris-缓冲盐水（TBS))也可增加波峰组分的体积，导致抗原 和蛋白质的明显更高的产率。这一效果或许应归因于预料不到的提高的蛋白质和病毒抗原 进入包含生理学浓度的盐和生理学pH的糖梯度的流动性。不同的超速离心条件（例如，有 和没有预澄清器以及不同的重力荷载）清楚地显示，通过蔗糖梯度的这些改变，能够实现 显著的产率提高和病毒颗粒聚集的减少。
[0013]优选添加的电解质大于 50m0sm/kg、100m0sm/kg、150m0sm/kg、200m0sm/kg或 250m0sm/kg，并且小于 500m0sm/kg、450m0sm/kg、400m0sm/kg或 350m0sm/kg，优选约 300m0sm/kg。应注意，在不进行范霍夫斯（van'tHoffs)因子矫正的情况下，将电解质 含量计算转换为等效的水溶液渗透压。另外，梯度形成物质（例如，蔗糖）的贡献未被用 于计算。例如，来自电解质的渗透压计算如下：8gNaCl/kg/58.44g/mol= 136.9mmol/ kgX2(个离子 /mol) = 273. 8m0sm/kg+20mM/kgTRISX2 个离子/mol= 40m0sm/kg;总计 (NaCl+TRIS) 313. 8m0sm/kg)。pH值能够在生理学范围内，优选在5. 5和9. 5之间；更优选 在5. 5和8. 5之间；尤其优选高于5. 5、6、6. 5或7并且低于9. 5、9. 0、8. 5、8或7. 5 ;尤其优 选在7. 0和7. 5之间或者在7. 0和7. 4之间。
[0014] 在尤其优选的实施方式中，用于产生密度梯度的糖是蔗糖。然而，本发明预期还可 使用其他糖，包括醇类糖在内。其非限制性的实施例是山梨糖醇。另外，本发明预期可使用 氢化糖、线性糖、改性糖或任何其他糖，只要该糖的水溶性足以产生具有在此限定的密度的 溶液即可。在相同层或不同层中的糖的组合（即，两种以上的糖）也可以被用于产生在此 描述的梯度，只要组成那些层的对应的糖溶液具有在此限定的密度即可。
[0015] 在优选的实施方式中，梯度形成制品的体积相对于超速离心转子或对样本施加 离心力的装置的有效体积的比率是在5%至100%之间，优选高于5%、10%、15%、20%、 25%、30%、32%、35%、40%、45%或