诱导表达抗菌肽的植物表达载体及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于柑桔品质改良技术领域，具体涉及诱导表达抗菌肽的植物表达载体及 其用途。
【背景技术】
[0002] 柑桔溃疡病是一种世界性病害，发生于亚洲的几乎每一个柑桔生产国以及除了地 中海国家以外的其它地区。柑桔溃疡病细菌主要危害新叶、嫩枝和未成熟的果实，严重时落 叶、枯枝、落果，树势衰弱，产量降低，果实品质变劣，一旦疫情在柑桔主产区传播蔓延，对柑 桔产业具有毁灭性、灾难性打击。目前，世界各国尚不能通过药剂或人工摘叶等方式来完全 根治柑桔溃疡病害，而只能采取铲除发病植株及其周边一定区域内的柑桔植株等一系列措 施，来彻底清除溃疡病菌寄主和根除柑桔溃疡病，为此，对果农来说，经济损失非常严重。
[0003] 随着植物转基因技术的不断发展，许多柑桔品种的遗传转化技术已被成功建立， 于此同时许多功能基因已被成功导入柑桔基因组中，获得了许多性状改良的转基因材料： 陈善春等（1996)将柞蚕抗菌肽D基因转化锦橙、新会橙和沙田柚；罗赛男等（2008)用 TERF1基因提高了冰糖橙抗溃疡病的能力；Cardoso等（2010)用人抗菌肽基因attacinA 转化甜橙并获得了抗柑桔溃疡病的株系；Mendes等（2010)用水稻抗白叶枯病基因Xa21 转化4个甜橙品种并获得部分抗溃疡病细菌的株系；Li等（2011)将溃疡病细菌无毒基因 PthA的NLS序列导入甜橙中，提高了柑桔抗溃疡病的能力；He等（2011)将抗菌肽Cecropin B和ShivaA双价基因转入锦橙和甜橙中并获得对溃疡病细菌有显著抗性的株系。上述 抗性基因的表达策略主要由CaMV35S组成型启动子控制。抗性基因的组成型表达往往会 对植物带来诸如持续激活植物在逆境条件下才合成的蛋白质和代谢产物、打破植物体内激 素平衡、连续刺激系统免疫应答反应等不利影响；而且其安全性、专一性和表达效率存在问 题。
[0004] 利用病原物诱导启动子控制抗病基因一直是植物抗病基因工程育种研宄的一大 热点。该策略具有如下优点：①在无相应的病原微生物浸染时，抗病基因保持沉默，不会对 植物造成任何不利影响；②当植物受到病原微生物入侵时，病原物诱导启动子能立即驱动 抗病基因在浸染位点表达，植物防卫反应随即启动，有关保护蛋白基因亦被激活，并能迅速 有效地抵抗病原微生物的侵害；③抗性基因在病原物诱导启动子控制下，在植物的非侵染 部位可以保持沉默，因而能有效避免抗菌蛋白可能带来的食用安全问题（如转基因果实的 食用安全）；④因此，相对其它类型启动子，利用病原物诱导启动子调控抗性基因的表达更 有利于转基因植物经济有效使用体内物质和能量、提高抗性和产量。
[0005] 目前，还没有关于利用病原物诱导启动子控制抗菌肽基因提高柑桔抗性的研宄报 道。可能的原因在于：一、大多数病原物诱导启动子的强度远远低于CaMV35S等组成型强 启动子；二、抗菌肽作为外源小分子肽，在植物细胞内极易被胞内蛋白酶降解而活性大大降 低。因此，病原物诱导启动子指导抗菌肽的表达水平往往难于到达杀菌效果，无法有效提高 转基因植株的抗性水平。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是为改良柑桔溃疡病抗性提供一种新选择。
[0007] 本发明的技术方案是诱导表达抗菌肽的表达框架，采用柑桔溃疡病病原菌高效诱 导表达启动子调控天蚕素抗菌肽的表达。
[0008] 优选的，所述的天蚕素抗菌肽为植物细胞间隙分泌型天蚕素抗菌肽，其核苷酸序 列如SEQIDNo. 10所示。
[0009] 具体的，所述的启动子为烟草病原物诱导启动子PPP1、马铃薯病原物诱导启动子 gstl或烟草病原物诱导启动子hs203J;启动子PPP1的核苷酸序列如SEQIDNo. 3所示；启 动子gstl的核苷酸序列如SEQIDNo. 6所示。
[0010] 优选的，所述启动子为PPP1。
[0011] 本发明还提供了还有所述表达框架的植物表达载体。
[0012] 具体的，采用PPP1启动子的植物表达载体中所包含的T-DNA具有如SEQIDNo. 18 所示的核苷酸序列；采用gstl启动子的植物表达载体中所包含的T-DNA具有如SEQID No. 19所示的核苷酸序列。
[0013] 本发明还提供了含有所述植物表达载体的宿主细胞。
[0014] 优选的，所述宿主细胞为农杆菌。
[0015] 本发明还提供了所述植物表达载体在改良柑桔溃疡病抗性中的用途。
[0016] 本发明还提供了所述的宿主细胞在改良柑桔溃疡病抗性中的用途。
[0017] 本发明还提供了增强柑桔溃疡病抗性的方法，包括如下步骤：将所述诱导表达抗 菌肽的植物表达载体通过遗传转化柑桔，获得对溃疡病抗性增强的柑桔。
[0018] 本发明中，植物表达载体中的T-DNA的两端为介导遗传转化的左边界和右边界， 在左边界和有边界之间为诱导表达抗菌肽的表达框架和筛选基因表达框架。在应用中，可 根据需要将该T-DNA构建到不同的植物表达载体骨架上，构建得到本发明植物表达载体， 发挥增强柑桔对溃疡病抗性作用。
[0019] 本发明的有益效果：本发明通过利用溃疡病病原菌高效诱导启动子指导抗菌肽等 抗性基因在病原菌入侵部分的高效表达，进而增强柑桔溃疡病的抗性水平。最终通过病原 诱导启动子驱动抗菌肽等基因增强柑桔对溃疡病病原微生物侵害的诱导性防疫反应，对于 提高柑桔抗病性和产量具有十分重要的理论和经济价值。本发明通过将溃疡病高效启动子 调控下的抗菌肽基因mAATCB整合到柑桔基因组中，实现了抗菌肽基因在柑桔受溃疡病病 原菌入侵时迅速高水平表达；从而增强了柑桔溃疡病抗性。
【附图说明】
[0020] 图1载体pC-PPPl-mAATCB的构建路线图。
[0021] 图2载体pC-gstl-mAATCB的构建路线图。
[0022] 图3载体pC-hs203J-mAATCB的构建路线图。
[0023] 图1~3中：Kanamycin，卡那霉素抗性基因；Amp，氨苄青霉素抗性基因；NPTII，新 霉素磷酸转移酶基因；GUS，葡萄糖酸苷酶基因；CaMV35S(35S)，来源于花椰菜花叶病 毒的植物组成性启动子；nos，冠瘿碱合成酶基因终止子。用于构建植物表达载体的骨架载 体为PCAMBIA1305. 1基础上改造的pC载体，具有CaMV35S启动子调控下的⑶S基因， 便于在植物遗传转化的过程中对转化子进行GUS染色的筛选。
[0024] 图4外源基因在转基因柑桔中的PCR验证。提取柑桔叶片DNA，PCR检测抗菌肽基 因在柑桔基因组中的整合。A:PPPl-mAATCB转基因植株PCR验证；B:gstl-mAATCB转基因植 株PCR验证；C:hs203J-mAATCB转基因植株PCR验证；M:DNAmarker;WT:野生型对照；1~ 12:转基因植株；P:以质粒为模板进行的PCR。
[0025] 图5外源基因在转基因柑桔中的Southernblot分析。15个转基因植株的基因组 DNA经HindllI酶切后，用mAATCB-nos基因片段进行Southern杂交。在不同的株系中得到 了不同大小和不同数量的杂交片段。野生型对照中没有杂交信号。1~5为hs203J-mAATCB 转基因植株；6~10为PPPl-mAATCB转基因植株；11-15为gstl-mAATCB转基因植株；WT为 野生型对照。
[0026]图6mAATCB在转基因柑桔PPPl-mAATCB(A)、gstl-mAATCB(B)、hs203J-mAATCB(C)、 中受柑桔溃疡病病原菌诱导表达的Real-timePCR定量分析。
[0027] 分别用水和柑桔溃疡病病原菌Xac菌液处理植株叶片24h，然后提叶片总RNA， real-timePCR定量分析抗菌肽基因的表达水平，以水处理为对照，计算溃疡病病原菌诱导 抗菌肽基因的相对表达水平（即诱导倍数）。结果显示在PPPl-mAATCB(A)转基因植株中抗 菌肽基因的相对表达水在3-17倍之间，明显高于其在gstl-mAATCB(B)转基因植株中的相 对表达水平，而在hs203J-mAATCB(C)转基因植株中没有检测到抗菌肽基因的表达。WT:野 生型柑桔。
[0028] 图7转基因植株与非转基因植株溃疡病抗性比较
[0029] 离体针刺法接种溃疡病实验，与野生型对照相比，分别统计分析接菌5天和10天 针刺点发病率（A)和病情指数（B)。结果显示，？?？1-1^4!1^(?5、？72、？124、？193)对溃疡病 的抗性显著强于野生型对照；gstl-mAATCB(G3、G5、G10)转基因植株中在接菌5天时抗性显 著强于野生型，但10天后，大部分转基因植株与对照无显著差异；hs203J-mAATCB(H9,H60) 转基因植株溃疡病抗性与对照无显著差异。WT:野生型柑桔；5DAI:接菌后5天；5DAI:接菌 后10天。
【具体实施方式】
[0030] 本发明实施例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体 说明的均参考《分子克隆实验指南》（Sambrook和Russell, 2001)。
[0031] 下述为本发明实施例中所涉及到实验操作介绍。
[0032] 1.DNA的提取
[0033]柑桔、马铃薯、烟草的基因组提取均使用Aidlab公司试剂盒（cat.No.DN15)，提取 的基因组DNA于-20 °C保存备用。
[0034] 质粒DNA的提取使用OMEGA公司质粒提取试剂盒（cat.No.D6943-01*)。
[0035] 2.RNA的提取及cDNA的合成
[0036] 选取柑桔叶片0?lg用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（Aidlab,cat.No.RN09) 提取叶片总RNA，用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量。cDNA 第一链的合成按照BIO-RADiScriptTMcDNASynthesisKit(BIO-RAD,cat.No. 170-8891) 说明书进行。合成的cDNA于-20保存备用。
[0037] 3.基因组序列的PCR扩增
[0038] 扩增体系：10XExPCRbuffer(Mg2+free)2. 5yL，2. 5mmol/LdNTPs2yL， 25臟〇1/1]\%(：122 1^，引物1(5 11111〇1/1)11^，引物2(5 11111〇1/1)11^，￡叉1&9〇嫩聚合酶 1U，基因组DNA约 60ng，加ddH20 至 25yL。
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