一种检测遗传性耳聋易感基因突变的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生物技术领域，特别是涉及一种用于检测遗传性耳聋易感基因突变的多 重连接探针扩增检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 聋病是临床上最常见的遗传性疾病之一，也是影响人类健康的常见疾病。据统计， 中国听力语言残疾者有2780万人，占全国现有残疾人总数的34%，其中单纯听力残疾的有 2004万人，听力残疾现残率约为2. 11 % ;每1000个新生儿中就有1~3例聋儿，7岁以下 聋儿约有74万人，并以每年2~3万的速度增长。约60%的新生聋儿是由遗传因素导致 的。另外在大量迟发性听力下降患者中，许多患者因自身基因缺陷而致病，或因基因缺陷和 多态性对特定环境因素易感而致病遗传性耳聋，还有40%为环境因素所致。减少耳聋的发 生重在早期的预防与干预，对于环境因素导致的耳聋，可以通过预防感染、加强孕期围产期 保健、避免应用耳毒性药物等措施有效地预防；但对于遗传性耳聋的预防，关键是明确耳聋 病因。
[0003] 遗传性耳聋绝大多数为异质性较强的单基因遗传病，其中30%的遗传性耳聋病例 属于综合征性耳聋，其余的遗传性耳聋绝大多数非NSHL。迄今为止，与NSHL相关的40个 常染色体隐性基因、25个常染色体显性基因、3个X连锁基因已被克隆。大规模耳聋分子流 行病学研究表明，我国人群中最常见的致病基因包括间隙连接蛋白P2GJB2(Gap Junction protein beta 2)、间隙连接蛋白 P3GJB3(Gap Junction protein beta 3)、SLC26A4(PDS)、 线粒体 DNA (Mitochondrion DNA)12S rRNA。
[0004] GJB2基因编码的Cx26属于缝隙连接蛋白基因家族，与相邻细胞的缝隙连接蛋白 组成一个完整的缝隙连接通道，这些通道在信息传导和物质交换中起重要作用，是完成电 解质、第二信使和代谢产物的细胞间转换的重要通道。当毛细胞受到外界刺激后，钾离子 经内耳毛细胞循环回流进入耳蜗内淋巴液，缝隙连接蛋白通道在此过程中具有调控作用。 Cx26在人类的耳蜗毛细胞中高表达，因此GJB2基因突变与耳聋密切相关。大部分GJB2基 因编码区的突变导致蛋白质翻译过程中的移码突变，产生无功能的蛋白质，影响了缝隙连 接蛋白的结构，从而影响通道的正常开闭。
[0005] GJB3基因突变可导致显性或隐性遗传性非综合征性耳聋。初步的功能学研究结果 揭示了 GJB2基因编码的Cx26与GJB3基因编码的Cx31的相互作用及其双基因的解剖、生 理和功能学基础。GJB3基因与GJB2基因虽然不在同一条染色体上，但都编码连接蛋白，在 内耳离子平衡中发挥作用，按照双等位基因致聋的模式，有可能GJB2基因与GJB3基因共同 导致耳聋患者的发病。
[0006] SLC26A4基因，或称PDS基因，所制造的蛋白质为pendrin，是一个氯及碘离子的运 输蛋白。一般以为其在内耳中主要是扮演调节离子均衡与内淋巴液的作用，若发生突变，就 会导致内耳发育畸形及听障。SLC26A4基因属于隐性遗传，双等位基因病理性突变会导致的 遗传性耳聋。此基因突变与大前庭水管综合征和耳蜗畸形有非常密切的关系。
[0007] 线粒体DNA突变易导致药物性耳聋，发病过程中，部分患者对氨基糖甙类抗生素 有易感性，即应用正常剂量或微量的药物就可以造成患者听力损失，这种易感性通常是母 系遗传。毛细胞线粒体损伤导致其产能功能丧失，是听力损害的细胞学基础。mtDNA是人体 细胞质内的闭环DNA，全长为16569bp，编码呼吸链中的13个关键酶亚单位，2个rRNA，22个 tRNA。由于mtDNA无组蛋白保护，是裸露的，所以其突变较核基因高10-20倍。另外mtDNA 不含内含子，部分区域还有基因重叠现象。因此mtDNA的任何突变都会累及到基因组中的 某一个重要功能区。
[0008] 上述致病基因包括多个突变位点，GJB2 :35delG、299delAT ;GJB3 :250G>A、 538C>T、547G>A ;SLC26A4(PDS) :707T>C、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、 2168A>G、IVS7-2A>G、IVS15+5G>A ;mtDNA 12S rRNA :1494C>T、1555A>G。以上 16 个基因突 变位点属于中国人群突变热点，对其进行检测，并结合临床问诊和查体，可以诊断我国80% 以上的遗传性耳聋。
[0009] 当前临床上对遗传性耳聋致病基因诊断的主要方法包括限制性长度多态性分析 (RFLP)、斑点杂交（AS0)、基因扫描、变性高效液相色谱分析（DHPLC)、直接测序、基因芯片 方法等。但这些技术或耗时费力，或成本较高，或难以同时检测多个基因的不同突变位点。 为解决临床快速检测和大规模人群筛查的问题，需要一种高效、高通量、快速、方便的方法 检测基因突变。多重连接探针扩增技术具有高效、可平行检测的特点，充分满足这一需求。 与芯片技术相比，多重连接探针扩增技术具有检测灵敏性高、稳定性好、经济高效、耗时短 和通量高等优点，其应用于临床耳聋基因筛查的优越性明显，如用于孕前预防、孕期干预和 产后筛查等。
[0010] 综上所述，目前现有技术中未见采用多重连接探针扩增技术诊断技术在GJB2、 GJB3、SLC26A4和线粒体基因上同时挑选一些多态性突变位点构成复合扩增检测系统的报 道，实践中亟需一种操作简便和实用性强，且快速、高效、经济、直观的检测试剂盒。
【发明内容】
[0011] 所要解决的技术问题
[0012] 本发明所要解决的技术问题是提供一种基于多重连接探针扩增技术，检测遗传性 耳聋易感基因突变情况的检测试剂盒，以克服现有试剂盒仅针对单个或少数部分突变位点 进行检测且操作复杂实用性差的缺陷。
[0013] 技术方案
[0014] 本发明的技术方案之一是提供一种利用多重连接探针扩增检测遗传性耳聋易感 基因突变位点的试剂盒，包括检测探针和通用引物；所述检测探针为每一条短探针和一条 长探针对应一个突变位点；所述突变点为：
[0015] GJB2 :299-300delAT、35delG;
[0016] GJB3 :250G>A、538C>T、547G>A;
[0017] 12SrRNA:1494C>T、1555A>G;
[0018] SLC26A4 :707T>C、 IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、 IVS15+5G>A、1975G>C、 2027T>A、2168A>G。
[0019] 上述试剂盒的优选技术方案之一为，所述突变位点所对应的短探针依次分别为：
[0020] GJB2 ：SEQ ID N0:USEQ ID NO:2 ；
[0021] GJB3 :SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5 ;
[0022] 12SrRNA :SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7 ;
[0023] SLC26A4 :SEQ ID N