粪便dna定量甲基化特异性pcr检测试剂盒及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种粪便中结肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测试剂盒，特别涉 及其在中国肠癌患病人群的表观突变分析与后果评估。
【背景技术】
[0002] 结直肠癌是我国大中城市发病居第二、三位的主要恶性肿瘤，早期发现、早期治疗 的效果比较理想。因此，寻找一种无创型的，具有高灵敏度及特异性的早期检测方法显得尤 其重要。
[0003] 已知抑癌基因的表观突变是癌症发生的早期事件，DNA启动子区的异常甲基化可 导致相关基因的沉默或低转录活性，使相关蛋白的表达异常，引发癌症。研宄发现，肠癌发 病相关抑癌基因SPG20、SNCA及FBN1等特定启动子内CpG岛区域的甲基化水平在患者瘤 组织和正常肠粘膜组织中差异明显，提示表观遗传标记物在结直肠癌早期诊断中的可能价 值。肠黏膜的周期性脱落会随粪便排出体外，藉此，可利用粪便中相关基因qMSP及BSP方 法检测DNA甲基化水平，开发一种方便快捷的结肠肿瘤早期筛查方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是，提供一种粪便中结肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测试剂 盒及其应用。
[0005] 本发明的技术方案是：粪便DNA定量甲基化特异性PCR检测试剂盒，包括以下成 分：
[0006] (1)肠癌发病相关的3种抑癌基因启动子区CpG岛定量甲基化扩增引物3对及探 针3条，各对引物序列见表1 ;
[0007] (2) PCR扩增试剂，如dNTP、Ex Taq Hot Start、Premix Ex Taq?聚合酶等。
[0008] 表1 CpG岛扩增引物及探针序列
【主权项】
1. 一种粪便中结肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测试剂盒，其特征在于包括以下 成分： (1) 结肠肿瘤发病相关的抑癌基因启动子区CpG岛定量甲基化扩增引物3对、探针3 条；（2)PCR扩增用试剂； 所说的3对定量甲基化扩增引物序列如下： 第1对^基因qMSP分析引物57f，qMSP，用于扩增基因启动子区CpG位 点处胞嘧啶甲基化的片段； F: 5，- TGACGCGAAGCGTTCGAGAGCGCG-3' R: 5，-CGCTCGCCGAAAACCGATCCCGAA-3，； 第2对：5AO基因qMSP分析引物5AO_qMSP，用于扩增5AO基因启动子区CpG位点处 胞嘧啶甲基化的片段； F: 5'- TTTTTGTTTTTTTATTTTCGTGAGC-3' R: 5'-AAAAAAAACCGCTATAAACCGAC-3'； 第3对：/?V7基因qMSP分析引物/?V7_qMSP，用于扩增/?V7基因启动子区CpG位点处 胞嘧啶甲基化的片段 F: 5'- GGTAGAGATTGTGGGTGTTATAAGC -3' R: 5'-ACTAAAAAAACGACGACTCCG-3' ； 所说的3条定量甲基化分析探针序列如下： 第1条：57???堪因qMSP分析探针5Pdprobe，用于分析57???堪因启动子区CpG位 点处胞嘧啶甲基化的片段； 5,-6FAM-CGTAACAACCAAAACGTTCCACG-TAMRA-3，； 第2条基因qMSP分析探针5AO_probe，用于分析5AO基因启动子区CpG位点 处胞嘧啶甲基化的片段； 5,-6FAM-CGCTAACCTATCGTCGAATAACC-TAMRA-3，； 第3条：/?V7基因qMSP分析探针/?V7-probe，用于分析/?V7基因启动子区CpG位点 处胞嘧啶甲基化的片段 5,-6FAM-CGACGACGACTACTCCCAATCG-TAMRA-3, 。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括亚硫酸氢盐修饰试剂、PCR扩增试 剂为dNTP、ExTaqHotStart、PremixExTaq? 聚合酶。
3. 权利要求1-2之一所述的试剂盒用于检测粪便中结肠肿瘤发病相关抑癌基因表观 突变。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒的应用，其特征是检测基因启动子区CpG岛甲基化步 骤如下： 提取粪便样本肠粘膜组织DNA; (2) DNA亚硫酸氢盐修饰：经过磺化、水解脱氨和碱性条件下去磺化三个主要步骤，将 非甲基化的胞喃啶转化为尿喃啶；而5-甲基-胞喃啶不能进行该反应； (3) 基因启动子区CpG岛甲基化分析： 采用定量甲基化特异性PCR，适用于基因CpG岛甲基化筛查； 针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA序列设计引物及探针；引物及探针在CpG二联核苷处，设 计为CG，只能扩出甲基化的DNA;将待测样本DNA结果与甲基化阳性对照比较，用这种特异 性扩增的方法来定量检测DNA中胞嘧啶的甲基化情况； qMSP法的具体步骤为： A. qPCR扩增反应体系， 根据所述引物及探针，反应体系为IOMl :TaKaRa Premix Ex Taq?聚合酶5yl、上 游引物（0.9yM)0.卯1、下游引物（0.9yM)0.卯1、TaqMan探针（3yM)0.4W、亚硫酸 氢盐修饰DNA (2〇Ong/W) 2.6W、ROXRef 0.2耵； B. qPCR反应条件： 95°C预变性30 sec;95°C变性10 sec，60°C左右复性30 sec，其中ACTIN50°C，ALU55°C，SNCA60°C或55°C，SPG20 55°C ;在实时定量PCR仪上完成。
【专利摘要】本发明涉及粪便中检测结肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变试剂盒及其用途。试剂盒包括：(1)结肠肿瘤发病相关的抑癌基因启动子区CpG岛定量甲基化扩增引物3对及探针3条；(2)PCR扩增用试剂。通过本试剂盒得到的PCR扩增产物，可以通过定量甲基化特异性PCR(quantitative methylation specific PCR,qMSP)方法分析基因CpG岛甲基化状态。本试剂盒具有高效的CpG岛甲基化检出作用。用于粪便中结肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104694637
【申请号】CN201510079061
【发明人】金黑鹰, 范怡梅, 杨青蓝, 邓超
【申请人】南京市中医院
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年2月13日