基于dna链取代循环放大技术检测dna甲基转移酶活性的比色传感方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于DNA链取代循环放大技术检测DNA甲基转移酶活性的比色传感方法，属于比色传感技术领域。
【背景技术】
[0002]DNA甲基化在很多正常细胞的生长过程包括细胞分化、转录沉默、基因调控、X染色体失活和一些其它过程中扮演着非常重要的角色。不同的甲基转移酶会导致不同的异常DNA甲基化，DNA甲基化与很多基因疾病和癌症密切相关，使得DNA甲基转移酶成为多种癌症治疗的潜在靶向目标和生物标志物。在恶性肿瘤中，甲基转移酶活性的异常一般都比其它的现象先显现出来，因而可以用于癌症的早期诊断。所以，发展灵敏的甲基转移酶活性检测方法对癌症的诊断和治疗是非常必要的。DNA甲基转移酶活性检测的传统方法有放射性标记法、液相色谱/质谱法、高效毛细管电泳、荧光法、比色法、电化学法、电致化学发光法和化学发光法，但是，仍然存在放射性标记物污染、昂贵的抗体或荧光标记、大型的检测设备、样品准备和数据分析耗时费力等问题。因此，需要发展更简单灵敏的DNA甲基转移酶活性检测方法。
[0003]AuNPs有高的消光系数和强的尺寸依赖的表面等离子体共振(SPR)特性，其分散和团聚状态使得AuNPs溶液的颜色可由红色变成蓝色，此过程伴随着SPR特征的变化，因其颜色和吸光度变化明显，AuNPs成为设计比色传感平台的理想纳米材料。但是，AuNPs比色法的检测灵敏度较低，所以发展基于放大技术的AuNPs比色方法非常必要。DNA链取代反应发生在两链不等长的双链DNA和单链DNA之间，它们把立足点当做引发位置，使得DNA以“点对点”可控程序方式进行快速重组。这样的优势之一是由于取代反应发生在已经设计好的位置上，因此链取代的路线可以被预测。此外，参与反应的所有寡核苷酸序列都是已知的，所有可能出现的差错如链取代过程中的缺失、插入、或点突变等都能考虑进来，因此，可以预测动力学、热力学和置换反应的结果。然而，尚未见DNA链取代放大技术与AuNPs相结合用于检测DNA甲基转移酶活性的比色传感方法的报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于发展一种基于DNA链取代循环放大技术检测DNA甲基转移酶活性的比色传感方法，它具有检测灵敏和简单快速的优点。
[0005]本发明是这样实现的，一种基于DNA链取代循环放大技术检测DNA甲基转移酶活性的比色传感方法，其特征在于包括以下步骤:
(I)制备AuNPs:在圆底烧瓶中加入49 mL超纯水和I mL质量百分浓度为2%的HAuCl4.3H20溶液，加热使之沸腾后，加入I mL质量百分浓度为5%的柠檬酸三钠溶液，持续搅拌并保持沸腾5分钟后，搅拌下使溶液自然冷却至室温，即制备成粒径13 nm且浓度为12 nM的AuNPs，在4 0C保存备用； (2 )制备AuNPs标记的探针DNA:将5.5 nM活化后的探针DNA加入到3 mL步骤(I)制备的AuNPs溶液中，室温下在摇床上震荡12小时，加入磷酸调节溶液中磷酸根的浓度为9mM，30分钟后，加入磷酸盐缓冲溶液，在随后的两天内分六次继续加入磷酸盐缓冲溶液，使NaCl的最终浓度为0.3 mM，陈化过夜。在转速15000 rpm下离心15 min，去除上清液，将沉淀分散在三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液中离心并清洗3次，去除未与Au NPs反应的探针DNA。将修饰好了的DNA-AuNPs分散在2 mL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液中，在4°(:冰箱中保存备用；
(3)比色传感方法:将20yL的lXNEBuffer2缓冲溶液、80 μMS-腺苷甲硫氨酸(SAM),40 nM发夹DNA I以及不同浓度的M.SssI混合，在37 ° C水浴中反应5小时，使得发夹DNA I部分发生甲基化；将混合物在65。C水浴中加热20分钟使M.SssI失活，再加入Hpall，在37 ° C恒温水浴中反应2小时，将未发生甲基化的发夹DNA I剪切为单链DNA碎片；向溶液中加入发夹DNA 11和探针DNA修饰的AuNPs，在37 ° C水浴中反应90分钟，DNA碎片中的reg1n I可与发夹DNA II杂交形成双链，DNA II进而与步骤(2)制备的AuNPs标记的两种探针DNA杂交，使得AuNPs被DNA II连接在一起，而取代出来的reg1n I继续与发夹DNA II杂交进入下一个链替换循环，如此循环，使得大量AuNPs发生聚集，溶液颜色由红色变浅甚至变成蓝色；用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液将反应液稀释到350μL测定紫外吸收光谱；
(4)M.SssI活性检测:随着Μ.SssI浓度的增大，发生甲基化的发夹DNA I增多，不能被HpaII剪切的发夹DNA I增多，分散的AuNPs就多，使得吸光度逐渐增大，Μ.SssI浓度的对数在0.l-50U/mL范围内与吸光度呈良好的线性，检出限为0.04 U/mL。
[0006]上述步骤中，步骤(2)中，所述的磷酸盐缓冲溶液均为浓度10 mM、pH 7.0、含2 MNaCl。步骤(2)和步骤(3)中，所述的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液均为浓度为10禮、pH为7.4，含50 mMNaCl。步骤(3)中，I XNEBuffer2缓冲溶液的组成为10 mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、50 mMNaClUO mM MgCl2U mM 二流苏糖醇，pH为7.9。步骤(3)中，所有的发夹DNA在使用前均在90。C水浴中加热10分钟再冷却到室温，进行退火杂交。
[0007]本发明的技术效果是:本发明利用DNA链取代循环放大技术和金胶聚集变色原理，发展了一种用于检测DNA甲基转移酶活性的比色传感方法，此方法具有简单方便的可视化检测、DNA链取代放大检测信号、灵敏度高、检测限低和选择性好等特点。
【附图说明】
[0008]图1是基于DNA链取代循环放大技术检测M.SssI活性的原理图。
[0009]图 2 是(a) DNAl/Γ-AuNPs+DNA I+M.Sssl+Hpall，(b) DNAl/1’-AuNPs+DNA I+HpaII， (c)DNA1/1’-AuNPs+DNA I+DNAII， (d)DNAl/Γ -AuNPs+DNAI+M.SssI+Hpall+DNAII，(e) DNA1/1' -AuNPs+DNAI+M.SssI (失活)+HpaII+DNAII, (f)DNAl/1’ -AuNPs+DNAI+HpalI+DNAII 的紫外-可见吸收光谱图。
[0010]图3 是在 SAM+HpaII+DNAI+DNAII+DNAl/1’ -AuNPs 样品中，(A)存在M.SssI 和(B)不存在M.SssI时AuNPs的TEM图。
[0011]图4是DNA链取代放大实验条件的优化！(A)DNAI浓度，(B) DNA1:DNAII, (C) SAM浓度，(D) HpaII浓度。
[0012]图 5 是⑷在 DNAl/1’ -AuNPs+DNAI+HpaII+DNAII 溶液中加入 M.SssI (O, 0.1,0.2, 0.5, I, 5，10，20，30，40，50，80，120 U/mL)时的紫外-可见吸收光谱图。(B)A/^与M.SssI浓度的对应关系，内插图是A/^与 1gC M sssI的线性关系。
[0013]图6是比色传感方法的选择性。M.SssI和Dam甲基转移酶均为50 U/mL，对照样品中M.SssI的浓度为O U/mL ο
【具体实施方式】
[0014]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，本发明并不限于此；
实施例1
(I)制备AuNPs:在圆底烧瓶中加入49 mL超纯水和I mL质量百分浓度为2%的HAuCl4.3H20溶液，加热使之沸腾后，加入I mL质量百分浓度为5%的柠檬酸三钠溶液，持续搅拌并保持沸腾5分钟后，搅拌下使溶液自然冷却至室温，即制备成粒径13 nm且浓度为12 nM的AuNPs，在4 0C保存备用；
(2 )制备AuNPs标记的探针DNA:将5.5 nM活化后的探针DNA加入到3 mL步骤(I)制备的AuNPs溶液中，室温下在摇床上震荡12小时，加入磷酸调节溶液中磷酸根的浓度为9mM，30分钟后，加入磷酸盐缓冲溶液，在随后的两天内分六次继续加入磷酸盐缓冲溶液，使NaCl的最终浓度为0.3 mM，陈化过夜。在转速15000 rpm下离心15 min，去除上清液，将沉淀分散在三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液中离心并清洗3次，去除未与Au NPs反应的探针DNA。将修饰好了的DNA-AuNPs分散在2 mL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液中，在4°(:冰箱中保存备用；
(3)比色传感方法:将20 μ L的I XNEBuffer2缓冲溶液、80 μ M SAM,40 nM发夹DNAI以及不同浓度的M.SssI混合，在37 ° C水浴中反应5小时，使得发夹DNA I部分发生甲基化；将混合物在65 ° C水浴中加热20分钟使M.SssI失活，再加入Hpall，在37 ° C恒温水浴中反应2小