细胞培养构件和细胞培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于在活体外进行人、动物等的细胞培养的细胞培养构件。另外，本发明涉及在活体外进行细胞的培养的细胞培养方法。
【背景技术】
[0002]在活体内，细胞具有某规则、三维地排列和配置。然而，现在的细胞培养中，涉及该细胞的排列.配置的技术是极有限的。
[0003]到目前为止，涉及二维的细胞排列已经有报告。例如，形成细胞粘接性表面和非粘接性表面的图案，由此进行细胞的二维粘接，接着控制增殖图案，由此进行。如果列举一例，现有的已知有:在基材上将温度灵敏性高分子用微细的线宽图案化的细胞培养支持体，和用该细胞培养支持体培养细胞的细胞培养方法(例如，参见专利文献I)。上述的细胞培养支持体能够用毛细血管的线宽将细胞培养部位图案化，所以能够二维地(膜面方向)控制培养细胞的结构。
[0004]与此相对，几乎不能存在三维的细胞排列的技术方法论。报告了将细胞片重叠而实现细胞的三维排列的技术(例如，参见专利文献2)。但是，不能说细胞重层化而成的内部的结构一定是被人为控制的。另外，提出了使现有的细胞三维地.立体地增殖从而制作块状的细胞块的细胞培养法。然而，该方法论中，三维的细胞排列不能人为地控制。
[0005]细胞的三维?立体培养(块状培养)中屡次产生向位于立体形状内部的细胞的供氧、供营养变差，内部细胞的功能降低，或者细胞死亡。与此相对，活体尽管是由细胞的三维的集合体构成，但是没有产生这样的问题。其理由是由于，三维细胞集合体中存在有血管，良好地向立体形状内部的细胞供给氧、营养。
[0006]这样，为了三维地使细胞生存、起作用，血管网的形成是关键(必须事项)。该血管网的形成还是三维的血管细胞的排列。与这样的体内的组织结构相近的细胞排列的控制技术的开发成为今后的细胞生物学的发展必不可缺的课题。
[0007]现有技术文献
[0008]专利文献
[0009]专利文献1:日本特开2010-98973号公报
[0010]专利文献2:日本特开2005-342112号公报
【发明内容】
[0011]发明要解决的问题
[0012]因此，本发明的课题在于得到能够在三维方向控制培养细胞(集合体)的结构的细胞培养构件。
[0013]本发明的其他的课题在于提供能够在三维方向控制培养细胞(集合体)的结构的细胞培养方法。另外，本发明的课题在于，能够在三维方向上控制第一细胞种的培养细胞(集合体)的结构，进而提供共培养第二细胞种的细胞培养方法。_4] 用于解决问题的方案
[0015]本发明中，利用细胞与细胞生长因子的浓度梯度对应的性质，来控制细胞的三维排列。首先，在基材上，将缓释(缓缓地释放)细胞生长因子的水凝胶层形成为二维图案。接着，在该形成了图案的基材上放置能够移动细胞的培养部位(例如，基底膜(matrigel))层，在该培养部位上接种细胞。
[0016]随着细胞生长因子的释放，在培养部位内形成细胞生长因子的三维浓度梯度图案。沿着该三维图案细胞移动。结果，培养部位内形成有按照细胞生长因子的三维浓度梯度图案的、细胞排列。
[0017]本发明将由水凝胶的细胞生长因子的缓释性和水凝胶的二维图案组合，能够在培养部位内形成三维的细胞排列。
[0018]本发明的一方式的细胞培养构件为在基板上形成有图案状且层状的水凝胶部位，覆盖前述水凝胶部位而形成有层状的培养部位，其特征在于，
[0019]前述培养部位的表面为第一细胞种接种面，
[0020]前述水凝胶部位浸润有细胞生长因子，
[0021]由前述水凝胶部位向前述培养部位缓释细胞生长因子。
[0022]本发明的细胞培养构件优选的实施方式中，前述水凝胶部位的厚度可以为由前述水凝胶部位向前述培养部位缓释细胞生长因子2天以上且21天以下的厚度，另外，前述水凝胶部位的厚度也可以为Iym以上且30mm以下。
[0023]对于本发明的进而其他优选的实施方式的细胞培养构件，
[0024]前述水凝胶部位可以由热交联明胶形成，另外，形成前述水凝胶部位的水凝胶的含水率可以为70%以上且99%以下。
[0025]本发明的细胞培养方法包括以下的工序。
[0026]工序a.在基板上形成图案状且层状的水凝胶部位
[0027]工序b.在前述水凝胶部位浸润细胞生长因子
[0028]工序c.覆盖前述水凝胶部位而形成层状的培养部位，从而完成细胞培养构件
[0029]工序d.在前述培养部位的表面接种第一细胞种的第一细胞种接种工序
[0030]工序e.将结束了第一细胞种接种工序的细胞培养构件置于培养条件下的第一细胞种培养工序
[0031 ] 本发明的细胞培养方法优选的实施方式中，
[0032]d工序的第一细胞种接种工序所使用的第一细胞种可以为接种前进行了饥饿处理的细胞，另外，将形成前述水凝胶部位的水凝胶的含水率设在70%以上且99%以下的范围，通过在前述范围内变更水凝胶的含水率，可以调节由前述水凝胶部位向前述培养部位缓释细胞生长因子的时间。
[0033]本发明的细胞培养方法的其他优选的实施方式中，
[0034]也可以接着作为e工序的第一细胞种培养工序，进行以下的工序:
[0035]工序f.在前述培养部位接种第二细胞种的第二细胞种接种工序；和
[0036]工序g.将结束了第二细胞种接种工序的细胞培养构件置于培养条件下的第二细胞种培养工序。
[0037]以上说明的本发明可以将本发明优选的实施方式、它们中包含的构成要素尽可能地组合而实施。
[0038]发明的效果
[0039]本发明的细胞培养构件具备具有浸润有细胞生长因子的一定厚度的水凝胶部位，细胞生长因子由水凝胶部位被缓释，所以与其他的发明技术特征相结合，培养中的第一细胞种由培养部位的表面向水凝胶部位移动时进行增殖。结果，不仅能够控制起因于水凝胶部位的图案形成的第一细胞种的培养细胞(集合体)的二维结构(基材的表面方向)，还能够控制培养部位向层厚度方向的结构。即，能够控制培养细胞(集合体)的三维结构。
[0040]本发明的细胞培养方法中，与上述细胞培养构件同样地，能够控制培养细胞(集合体)的三维结构。
【附图说明】
[0041]图1为细胞培养构件的截面说明图。
[0042]图2为去除了培养部位的细胞培养构件的说明图，图2的(a)为截面说明图，图2的(b)为平面说明图。
[0043]图3为第一细胞种的细胞培养方法的概念说明图，分别地，图3的(a)为第一细胞种刚接种之后的概念说明图、图3的(b)为第一细胞种培养初期的概念说明图、图3的(c)为第一细胞种培养后期的概念说明图。
[0044]图4为表示实施例的评价结果的曲线图。
【具体实施方式】
[0045]以下，参见附图对于本发明的实施例的细胞培养构件和细胞培养方法进一步进行说明。本说明书中，参见的各图为了使本发明容易理解，将一部分构成要素夸张地表达等示意地表示。因此，存在构成要素间的尺寸、比率等与实物不同的情况。另外，本发明的实施例所述的构件、部分的尺寸、材质、形状、其相对位置等，只要没有特别的记载，本发明的范围就不只限定于此，这些只不过是简单的说明例。
[0046]<细胞培养构件>
[0047]图1为细胞培养构件I的截面说明图，图2为去除了培养部位13的细胞培养构件I的说明图，图2的(a)为截面说明图、图2的(b)为平面说明图。
[0048]细胞培养构件I在基板11上形成有水凝胶部位12，覆盖水凝胶部位12而形成有培养部位13。水凝胶部位12为细胞生长因子的缓释用载体。另外，水凝胶部位12也是第一细胞种的增殖细胞的粘接部位。
[0049]基板11的形状通常为平板、薄平板或者薄膜状。在基板11上，水凝胶部位12形成为图案状，在没有水凝胶部位12的部分，细胞非粘接部分15露出。如果构成基板11的基材11-1由细胞非粘接材料(例如聚二甲基硅氧烷(以下，称为PDMS))形成，则基板11只由基材11_1构成。
[0050]如果基材11-1由细胞粘接材料(例如聚对苯二甲酸乙二酯(以下，称为PET))形成，则通过在基材11-1的上表面的整面层状地涂布细胞非粘接材料，从而形成细胞非粘接层11-2。本发明中，细胞非粘接层11-2可以根据基材11-1的材料、表面性质等有必要存在或不必要存在。
[0051]基材11-1的材料为:PDMS、PET、玻璃、硅、金属(氧化铝、SUS304等不锈钢、金、银等)、金属氧化物(氧化铝、氧化钛、氧化铟锡(ITO)、氧化锡)等。细胞非粘接层11-2的材料为琼脂糖、聚乙二醇、PDMS等。
[0052]水凝胶部位12形成为图案状且层状。形成为图案状的理由为用于控制第一细胞种的培养细胞集合体的二维(基板11的平面方向)形状。参见图2的(b)，本实施例中，水凝胶部位12为直线状，成为5根直线平行排列的图案。对于形成为图案状的水凝胶部位的线宽(箭头22)，没有特别的限制，优选为ΙΟμπι?500 μπι。对于形成为图案状的水凝胶部位相互间的间隔(箭头23)，没有特别地限制，优选为50 μπι?100ymo
[0053]水凝胶部位12形成为层状而赋予高度。通过赋予高度，对水凝胶部位12赋予体积，所以在水凝胶部位12浸润细胞生长因子溶液，由此用于细胞生长因子缓释的贮存变得可能。
[0054]为了贮存且缓释细胞生长因子，水凝胶部位12由水凝胶形成。
[0055]另外，对于形成为层状的水凝胶部位12的厚度(箭头21)，没有特别地限定。只要是对于接种的细胞在面向水凝胶部位12的方向移动、能够缓释增殖充分的时间和量的细胞生长因子的贮存量即可。
[0056]如果调节水凝胶的交联度，则能够调节细胞生长因子的缓释时间。作为对应于水凝胶的交联度的指标，有含水率。水凝胶的交联度通常为70%以上且99%以下，优选为90%以上且99%以下。因为如果将含水率设在该范围，则在第一细胞种的细胞培养期间中的全部期间，对于赋予第一细胞种的增殖细胞的增殖方向的充分的细胞生长因子被持续地缓释。
[0057]水凝胶部位12所要求的细胞生长因子的缓释期间优选为2天以上且21天以下。另外，水凝胶部位12优选的厚度为I μ m以上且3000 μ m以下，更优选为20 μ m以上且70 μ m以下。因为在第一细胞种的细胞培养期间中的全部期间，对于赋予第一细胞种的增殖细胞的增殖方向的充分的细胞生长因子被持续地缓释。
[0058]水凝胶部位12的材料为明胶、胶原蛋白、透明质酸、纤连蛋白、层粘连蛋白、纤维蛋白等，特别优选为明胶。因为明胶能够在比较低温下通过加热进行热交联。
[0059]水凝胶部位12的形成方法能够通过如下的任意方法进行:(I)在玻璃板等上制作成规定厚度的薄层物，将其切出而载置于基板11上的方法；(2)使用分配器(dispenser)载置凝胶状材料的方法；(3)用丝网印刷进行套印的方法；等。
[0060]培养部位13覆盖水凝胶部位12而形成为层状。如果考虑基板的平面方向，则培养部位13在该平面方向形成为面状。水凝