促进iPS细胞产生的螺环类化合物及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物化学领域，具体而言，涉及一种螺环类化合物及其制备方法，以及 所述化合物作为促进iPS细胞产生的小分子调节剂，在促进iPS细胞生成及体细胞重编程 作用机制研究中的用途。
【背景技术】
[0002] 多能干细胞（Pluripotentstemcells,PSCs)具有在较长时间内自我更新并 在体内或体外分化成三个胚层的所有细胞类型的能力。多能干细胞主要包括胚胎干细 胞（embryonicstemcells,ESCs)、上胚层干细胞（epiblaststemcells,EpiSCs)、种系 干细胞（germlinestemcells)以及由体细胞重编程产生的诱导多能干细胞（induced pluripotentstemcells,iPSCs)。相比之下，已分化的组织和器官中的谱系限制性干细胞 和祖细胞的自我更新和分化潜能较为有限，但它们也基本代表了细胞替代疗法和生物医学 研究所需的理想的细胞类型。要将干细胞及其调控方法引用到临床，首先必须了解在体外 或体内控制细胞命运和功能的分子机制并设计改进的操作方法。人源胚胎干细胞（human ESCS，hESCs)为人体各种功能细胞类型提供了潜在的无限的细胞来源。然而，迄今为止尚未 成功地从体细胞核移植胚胎产生特定病人的hESCs，人源胚胎以及体细胞核移植胚胎的使 用也存在伦理问题。另一个潜在的多能干细胞的来源是将已分化的体细胞重编程到多能状 态。这种方法有两个应用优势：1)规避了使用胚胎源干细胞的伦理问题，2)采用患者自身 的细胞而限制了免疫排斥。2006年，Takahashi和Yamanaka报道了小鼠体细胞可通过异位 表达特定的转录因子(如0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc)进行重编程而获得多能性，由此产生 iPSCs。2007年，科学家们获得了由人源体细胞经重编程产生的iPSCs，这一研究成果进一 步拓展了iPSCs在再生医学领域的应用潜能。这些iPSCs在体外及体内的总体基因表达、 表观遗传学特征和发育潜能都与ESCs非常相似，这也为表观遗传重编程、开发个性化的细 胞替代治疗、疾病模型和药物发现的研究工作提供了前所未有的契机。
[0003] 然而，传统的iPSC技术存在诸多妨碍其实际应用的关键性弊端。首先，对体细胞 的重编程需要进行永久性基因修饰，而其中所使用的外源性基因(例如，0ct4、Sox2、Klf4和 c-Myc四个重编程因子中的任一个)或是病毒转染系统都可能具有潜在的致癌性。目前，这 一问题已得到部分解决，研究人员通过基于质粒、蛋白或修饰RNA的策略替代病毒转染系 统，成功实现了无病毒的细胞重编程过程。然而，这些实验条件却降低了整个重编程过程 的速率和效率。其次，由上述四因子诱导的重编程过程一般都包含非特异或随机的步进式 过程，这使得生成iPS细胞只是诸多可能的细胞命运之一，这也是导致传统iPSC技术低效 率(只有0. 001%-0. 005%)和慢动力学的原因。重编程过程的这种内在的随机性也可能成为 iPS细胞的隐患，例如重编程过程中残存的表观遗传学记忆、引入不适当的表观遗传学变化 和一些敏感基因和表观遗传异常的累积和选择(可能增强了细胞生长途径而削弱了肿瘤抑 制途径)。如今，在有效生成更安全的iPSCs方面已取得了实质性的进展：研究人员已找到 了一些可提高重编程效率和动力学或替代外源性重编程转录因子功能的小分子化合物。例 如，研究人员发现一些可直接调控表观遗传学相关的酶和机制的小分子化合物可促进重编 程，其中包括组蛋白去乙酰化酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白去甲基化酶和DNA甲基转移酶 的抑制剂。此外，化学筛选和后续的机制研究也确定了iPS细胞生成过程中所涉及的关键 信号通路，包括钙调机制、Wnt/P-catenin信号通路的激活以及TGF-0信号通路的抑制。 最近，研究人员又成功地运用小分子化合物替代了重编程因子（Sox2、Klf4和c-Myc)的功 能，只用0ct4-个因子将多种鼠源或人源的细胞类型转化为iPS细胞。这些研究成果不仅 为产生iPSCs提供了更好的条件，也为揭示重编程的分子机制提供了一类独特方法。
[0004] 相比于传统的基于蛋白和基因的方法，通过化学方法调控细胞的重编程进程更具 实用性。首先，基于小分子化合物的重编程与体细胞核移植或基于转录因子的重编程(利用 基因、蛋白或mRNA)存在本质区别。体细胞核移植和基于转录因子的重编程都依靠天然来 源(来源于卵母细胞或在细胞中异位表达或通过其它方式引入）的主要转录因子直接作用。 而合成的小分子化合物并不具有特异的DNA识别区或转录调节区，它们通过对转录和表观 遗传调控进行非直接的调节来诱导重编程。其次，传统生物分子很难生产和操作，这使得它 们的使用非常有限。生物分子的作用效果不稳定，基因开关只有有和无两种状态，因而不能 进行微调。传统的生物分子在同一时间只能调控一个靶点，而在一个特定组织中引入多个 生物分子在技术上也较难实现。相比之下，小分子化合物可被高效地传递入细胞或是靶向 到特定的组织，通过作用于信号通路的节点对特定的表型进行靶向的多通路的可逆调控， 通过调节剂量可使化合物达到最佳疗效，而通过进一步的结构改造也可使化合物的作用效 果、安全性和稳定性得以提高。此外，小分子化合物的生产更为廉价，可根据需求缩放其生 产规模。这些优势都使小分子化合物在iPSC技术的发展中占据了有利地位。重要的是，小 分子化合物也为从非特异性的基于转录因子的重编程过程向真正的定向重编程过程的根 本转变提供了可能。
【发明内容】
[0005] 在干细胞生物学领域，多数活性小分子的发现来源于基于细胞表型、报告基因或 生物体的高通量筛选。在对先导化合物的靶点和相关信号通路进行进一步的确定后，再从 生物化学、药理学和生理需求等方面对其进行进一步的优化。基于此，本发明人利用96孔 板的四因子诱导的重编程筛选体系对小分子化合物库进行了基于细胞表型的筛选。从中， 本发明人发现了具有螺环结构的阳性化合物可在微摩尔级浓度下提高重编程效率并加快 重编程的进程。本发明人对此类螺环骨架化合物进行了结构改造和构效关系研究，获得了 一系列可在亚微摩尔级浓度下有效促进iPS细胞产生并加快重编程进程的螺环类化合物， 由此完成本发明。
[0006] 本发明的一个目的在于提供一种新型的螺环类化合物。
[0007] 本发明的另一目的在于提供所述螺环类化合物的制备方法。
[0008] 本发明的还一目的在于提供一种制备诱导多能干细胞的方法。
[0009] 本发明的又一目的在于提供所述的螺环类化合物在制备用于促进iPS细胞生成 的药物中的应用。
[0010] 本发明的又一目的在于提供所述的螺环类化合物在体细胞重编程作用机制研究 中的应用。
[0011] 根据本发明的一方面，本发明提供如下通式I所示的螺环类化合物或其药学上可 接受的盐：
【主权项】
1. 如下通式I所示的螺环类化合物或其药学上可接受的盐：
其中， Z为CR1或N; Rp R2、R3和R4各自独立地为H ;卤素原子；取代或未取代的氨基；氰基；取代或未取代 的C1-C20烷基；取代或未取代的C2-C6烯基；取代或未取代的C2-C6炔基；取代或未取代的 C3-C8环烷基；取代或未取代的C1-C14烷氧基；取代或未取代的C2-C6烯氧基；取代或未取 代的C2-C6炔氧基；取代或未取代的C6-C12芳基；取代或未取代的芴基；取代或未取代的 含有选自〇、N、S中的至少一个杂原子的3-8元杂环基；取代或未取代的含有选自0、N、S中 的至少一个杂原子的五元或六元杂芳基；取代或未取代的苯并的含有选自0、N、S中的至少 一个杂原子的五元或六元杂环基；取代或未取代的苯并的含有选自〇、N、S中的至少一个杂 原子的五元或六元杂芳基；或者取代或未取代的H(C pH2pO)q-，其中p为1、2或3, q为1、2、3 或4 ; R5、R6、R7、R8和R 9各自独立地为H ;取代或未取代的C1-C6烷基；取代或未取代的C2-C6 烯基；取代或未取代的C2-C6炔基；卤素原子；氰基；硝基；氨基；取代或未取代的C1-C6烷 氧基；取代或未取代的C2-C6烯氧基；取代或未取代的C2-C6炔氧基；苄氧基；取代或未取 代的H(C pH2pO)q-，其中p为1、2或3，q为1、2、3或4;取代或未取代的含有选自0、N、S中的 至少一个杂原子的3-8元杂环基； X为-0- ;-S-「[C(R1QRn)]t-，其中t为 1 或 2 ;-S(0)rC(R1QRn)-，其中！为 0、1 或 2 ; 或-OC(RltlR11)-;其中，各个Rltl和R11各自独立地为H、C1-C4烷基、C6-C12芳基或卤素原子， 优选各自独立地为H、甲基、苯基或卤素原子，更优选各自独立地为H、甲基、或卤素原子，特 别优选为H;最优选地，X为-o-、-sch2-、-och2-、-ch2-、-ch2ch2-、-s(=o)ch2-*-s(o2)ch2-; Y为-C(R12R13)-或-N=NC(R14R15)-;其中，R12 和R13 各自独立地为H、C1-C6 烷基、C1-C4 烷氧基撰基或竣基，并优选各自独立地为H、甲基、乙氧基撰基、甲氧基撰基或竣基；R14和R15 各自独立地为H或C1-C4烷基，并优选各自独立地为H或甲基，特别优选为H;优选地，Y为-CH2-、-N=NCH2-、-CH(CH3)-、-C(CH3) 2-或-CH(COOEt) _。
2. 根据权利要求1所述的通式I所示的螺环类化合物或其药学上可接受的盐， 其中，1^、1?2為和1?4各自独立地为11;卤素原子 ；氨基；氰基；(：1-(：14烷基；卤代(：1-(：14 烷基；C2-C6烯基；卤代C2-C6烯基；C2-C6炔基；取代或未取代的C3-C6环烷基；C1-C8烷氧 基；卤代C1-C6烷氧基；叠氮基取代的C1-C8烷氧基；二氮丙啶基取代的C1-C6烷氧基；取 代或未取代的吗啉基；取代或未取代的哌嗪基；取代或未取代的哌啶基；取代或未取代的 苯基；取代或未取代的芴基；取代或未取代的嘧啶基；取代或未取代的吡唑基；取代或未取 代的咪唑基；取代或未取代的噻吩基；取代或未取代的吡啶基；取代或未取代的苯并吡啶 基；取代或未取代的苯并吡唑基；取代或未取代的苯并噻吩基；取代或未取代的二氮丙啶 基；取代或未取代的H(C2H4O)q-，其中q为1、2、3或4 ;优选地，RpRyR3和R4各自独立地为H;F;C1;Br;氨基；氰基；甲基；乙基；叔丁基；十四烷基；三氟甲基；4-溴正丁氧基、8-叠氮 正半氧基；稀丙基；环丙基；甲氧基；二氣甲氧基；吗琳基；脈嚷基；苯基；莉基；啼陡基；批 唑基；噻吩基；批啶基；苯并吡啶基；苯并吡唑基；苯并噻吩基；二氮丙啶基；由选自卤素