血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽及其应用，具体涉及特异性抑制肿瘤组 织的血管内皮细胞的增殖和迀移，抑制肿瘤血管生成，治疗恶性肿瘤的多肽。
【背景技术】
[0002] 1971年Folkman提出肿瘤生长和转移依赖新生血管生成。并认为实体瘤形成后， 其发展可分为无血管期和血管期两个阶段。无血管期，微小肿瘤的存在依靠周围间质弥散 供血，生长速度呈线性，肿瘤限制在1mm~2mm之内，瘤细胞数少于105~10 6个，迫使肿瘤 处于"休眠状态";进入血管期后，肿瘤组织为灌注性供血，瘤体呈指数性生长，2周后可增大 1. 6万倍。新生血管不仅提供肿瘤所需要的营养和氧气，排除代谢产物，而且是远处转移的 途径。因此，阻断肿瘤新生血管形成就可能阻止肿瘤生长和转移，抗新生血管疗法也成为肿 瘤治疗的手段之一。
[0003] 血管内皮与基质细胞黏附分子对肿瘤血管生成的作用越来越受到关注。钙联蛋白 是一类依赖于钙离子的膜蛋白，是重要的细胞黏附蛋白，负责细胞与细胞的识别及细胞与 组织的黏附。钙联蛋白的表达具有组织特异性，在血管内皮细胞表达的是血管内皮钙联蛋 白（VE-cadherin)，这是一个潜在的肿瘤血管生成的革E1标。目前报道有一个以VE_cadherin 为靶标的抗体E4G10可以特异性识别肿瘤血管并抑制其生成，而不识别正常的血管。这可 能是因为该抗体识别VE-cadherin的抗原表位在正常血管上被掩盖，而在肿瘤血管上这个 表位被暴露出来，预示着潜在的临床应用价值。由此可见，抑制VE-cadherin可以有效抑制 肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤生长，使肿瘤处于"休眠状态"。
[0004] 目前，没有成熟开发的血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽问世，用于治疗恶性肿瘤。
[0005] 本专利中的血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽已证明在治疗胰腺癌中有效，具有在其 他肿瘤模型中开发的前景。
【发明内容】
[0006] 发明目的
[0007] 本发明提供全新的序列，该序列为血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽，特异性抑制肿 瘤组织的血管内皮细胞的增殖和迀移，对恶性肿瘤具有很好的疗效。
[0008] 技术方案
[0009] 血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽，其特征在于其序列为RCILTPCPASVMAVAATINPAY。
[0010] 血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽在治疗恶性肿瘤，如胰腺癌药物中的应用。
[0011] 有益效果
[0012] 利用固相合成法化学合成血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽，该多肽具有全新的序 列，该多肽可靶向识别肿瘤内皮细胞，并在体外抑制血管内皮细胞的增殖，治疗恶性肿瘤， 如胰腺癌。我们发现的血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽可以同时抑制血管内皮细胞迀移活 力，并在体内试验中提高荷瘤小鼠生存率，具有潜在的新药开发价值。
【具体实施方式】
[0013] 实施例1
[0014] 血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽人血管内皮细胞迀移的作用。
[0015] 采用划痕实验。先用marker笔在24孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每 隔0. 5~lcm-道，横穿过孔。每孔穿过3条线；将成对数生长的HUVEC细胞，以1.OX105 加入24孔培养板中，培养24h。第二天用10y1枪头比着直尺，垂直于背后的横线划痕，以 划痕和背后横线的交叉点为固定观察位点；实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的 实验药物血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽（上海生工合成）和阳性对照药物长春新碱；空白 组加入相同体积的溶剂，每孔设五个复孔；放入37°C、5%C02培养箱，培养。按0,6,12, 24， 36小时，拍照；测量0，6，12，24，36h划痕宽度。以不同的时间点，记录每孔三个固定位置处 划痕宽度的变化，即为细胞迀移距离。按照公式计算迀移率（migrationrate，MR):迀移率 (MR)=(实验第n小时的划痕宽度一实验第0小时的划痕宽度）X100% /实验第0小时 的划痕宽度。结果，随血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽浓度增加，迀移抑制率逐渐下降，说明 血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽能够抑制人血管内皮细胞迀移，抑制率为78. 3%。
[0016] 实施例2
[0017] 血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽对体外培养人血管内皮细胞的生长和存活IC50。
[0018] 采用MTT比色法。将对数生长的人血管内皮细胞HUVEC，以1.OX105加入96孔培 养板中，培养24h，实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物血管内皮钙联蛋 白拮抗剂多肽（上海生工合成）和阳性对照药物紫杉醇；空白组加入相同体积的溶剂。每 孔设五个复孔，培养 48h，分别在 011、211、811、1411、2011、2411、3611、，4811每孔加入]\〇'1'，作用411 后，加入DMS0,孵育30min，在酶标仪620nm处测定吸光度A值，按公式HUVEC生长抑制率= (1-实验组吸光值/对照组吸光值）X100%。计算出实验药物的IC50为12. 52yM。
[0019] 实施例3
[0020] 用肿瘤模型检测血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽的体内活力。
[0021] 建立胰腺癌肿瘤模型，阳性对照药物紫杉醇；空白组加入相同体积的溶剂，实验组 多肽（上海生工合成）设3个剂量：0. 25、0. 50、1. 00yM/Kg。21天后，观察小鼠存活数量， 计算存活率。结果显示，血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽可有效地保护小白鼠，提高荷瘤小鼠 的生存率，生存率达到78. 5%。
[0022] 实施例4含有血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽的ELISA试剂盒检测：
[0023] 酶连免疫吸附实验（ELISA)试剂盒包括如下试剂：
[0024] (1)包被液：0? 05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9. 6)。称取0? 75g碳酸钠，1. 46g碳酸氢 钠，加去离子水定容至500ml;
[0025] (2)PBS缓冲液：0? 02mol/L磷酸盐缓冲液（pH7. 4)。称取0? 2g磷酸二氢钾，2. 90g 磷酸氢二钠，8g氯化钠，加去离子水定容到1000ml;
[0026] (3)抗体稀释液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0? 2%BSA。称取 0? 2gBSA加入配好的 0. 02mol/L磷酸盐缓冲液溶解定量至100ml;
[0027] (4)封闭液：0? 05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9. 6)和2. 0%BSA。2.OgBSA加配好的 0. 05mol/L碳酸盐缓冲液溶解定量至100ml;
[0028] (5)洗涤液：0? 02mol/LPBS(pH7.4)和0? 05 % Tween-20。将50ulTween-20溶入 100ml0. 02mol/L磷酸盐缓冲液中，震荡混匀；
[0029] (6)底物液：可溶性单组份TMB底物溶液；
[0030] (7)终止液：2mol/L硫酸溶液。10ml98%浓硫酸加入60ml双蒸水中，定容至 100ml，室温保存；
[0031] (8)血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽
[0032] (9)VE_cadherin抗体购自上海一研生物科技有限公司
[0033] (10)二抗（山羊抗小鼠IgG)购自艾美捷科技有限公司
[0034] 使用方法：1、血清样本制备：取3只荷瘤裸鼠，进行眼眶取血，每只200yL，迅速 离心 12000rpm3min，取上清，按体积比 1 :2 加PBS，80°C水浴 30min，12000rpm3min取上 清，-20°C冻存备用。2、VE-cadherin抗体为包被抗体，将VE-cadherin抗体溶于包被稀释 液中，浓度为100ug/mL。96孔酶标板每孔加入100yL，4°C包被过夜。弃去包被液，加入封 闭液200yL，37°C封闭lh。弃去封闭液，分别加入样品稀释液稀释的血清样本100yL(稀释 比1 :50)和血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽100yL(10yg/ml)及上述血清样本50yL和血 管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽50yL的混合物，分成3组，37°C孵育lh。弃去血清，PBST和自 来水间隔洗涤三次。洗涤后，每孔加入样品稀释液稀释酶标二抗100uL(稀释比1 :10000)， 37°C孵育lh。弃去二抗，洗涤。洗涤后，每孔加入100yL底物液（50yL底物A，50yL底物 B)，37°C反应30min后，加入50yL2MH2S04终止反应，用酶标仪在450nm波长测定每孔的 光密度值〇D450nm。
[0035] 结果：血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽可以和VE-cadherin抗体竞争血清中结合 VE-cadherin，故说明血管内皮妈联蛋白诘抗剂多肽用竞争法检测VE-cadherin，
[0036] 实现肿瘤预测；
【主权项】
1.血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽，其特征在于其序列为RCILTPCPASVMAVAATINPAY。
2. 如权利要求1所述的血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽在治疗肿瘤药物中的应用。
3.如权利要求1所述的血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽在治疗胰腺癌药物中的应用。
4. 一种检测肿瘤的试剂盒，其含有权利要求1所述的血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于还有 (1) 包被液：p!19.6的0? 05mol/L碳酸盐缓冲液； (2)PBS缓冲液：pH7.4的0? 02mol/L磷酸盐缓冲液； (3)抗体稀释液：pH7. 4的0? 02mol/LPBS和0? 2% BSA ; (4)封闭液：pH9. 6的0? 05mol/L碳酸盐缓冲液和2. 0% BSA (5)洗涤液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和0? 05% Tween-20 ; (6)底物液：可溶性单组份TMB底物溶液； (7)终止液：2mol/L硫酸溶液； (8) 成纤维细胞生长因子抗体； (9) 山羊抗小鼠IgG。
【专利摘要】血管内皮钙联蛋白拮抗剂多肽及其应用。本发明涉及药物领域，具体涉及抑制肿瘤血管生成，治疗恶性肿瘤的多肽。其序列为RCILTPCPASVMAVAATINPAY是全新的序列，它们可以在体外特异性抑制肿瘤组织的血管内皮细胞的增殖和迁移，抑制肿瘤血管生成，并在体内试验中提高荷瘤小鼠生存率，具有潜在的新药开发价值，可以作为检测试剂盒检测肿瘤。
【IPC分类】G01N33-68, G01N33-574, C07K14-00, A61K38-16, A61P35-00
【公开号】CN104710514
【申请号】CN201510158902
【发明人】罗瑞雪
【申请人】苏州普罗达生物科技有限公司
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年4月6日