一种特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9纳米抗体及其应用

文档序号:8391699阅读:657来源:国知局
一种特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9纳米抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域,具体涉及一种抗PRRS病毒非结构蛋白Nsp9的纳米抗 体及其在抗PRRS病毒中的应用。
【背景技术】
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS) 又名蓝耳病,是由PRRS病毒(PRRSV)感染所致的一种猪的急性传染病。由于PRRS病毒 具有抗原变异性、嗜巨噬细胞性、抗体依赖性增强作用(ADE)和持续性感染等特征(Chand RJ:Pathogenesisofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus.Curr OpinVirol,2012, 2 (3) : 256-263),现有疫苗对该病的保护作用非常有限,而且目前还没有 抗PRRS病毒的特效药物。
[0003] PRRS病毒为单股正链RNA病毒,其基因的复制和转录依赖于病毒自身编码 的非结构蛋白,其中非结构蛋白Nsp9具有RNA依赖的RNA聚合酶活性(FangY:The PRRSVreplicase:exploringthemultifunctionalityofanintriguingsetof nonstructuralproteins.VirusResearch, 2010, 154 (2) :61-76),是病毒最重要的复制 酶,并且最新的研宄发现Nsp9与病毒的毒力有着密切的关系。因此Nsp9非常合适作为抗 病毒药物靶点。
[0004] 1993年Hamers等人发现骆驼体内存在一种仅具有重链的抗体,将其称为重链 抗体(heavy-chainantibodies,HCAbs)(Hamers-CastermanC:Naturallyoccurring antibodiesdevoidoflightchains.Nature, 1993, 6428(363) :446_448)。这类抗体的抗 原结合位点仅由重链的可变区VHH(variabledomainoftheheavychainofHCAbs,VHH) 单结构域形成。尽管天然缺失轻链可变区,却仍具有良好和广泛的抗原结合力。VHH抗体是 目前所发现的具有完整功能的最小分子抗体片段,分子量为15kDa,仅为常规抗体的1/10, 其分子高度4. 8nm,直径2. 2nm,故被称为纳米抗体(nanobody)。VHH抗体重要的特征之一 是其具有更长的抗原互补结合区(CDR),可结合一些常规抗体无法接近的抗原表位,如位 于酶蛋白裂隙中的活性中心结构G)eGenstE:Molecularbasisforthepreferential cleftrecognitionbydromedaryheavy-chainantibodies.ProcNatlAcadSci USA, 2006, 103(12) :4586-4591)。另外,它还具有易表达,水溶性好,稳定性强,免疫原性弱, 组织穿透性好等优点,使得该抗体作为一种小型化的基因工程抗体在基础研宄、药物开发 等领域有广阔的应用前景。

【发明内容】

[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种针对PRRS病毒非结构蛋白Nsp9并可以抑 制PRRS病毒增殖的纳米抗体,同时提供该纳米抗体的编码序和一种真核表达载体。
[0006] 本发明是通过以下的技术方案实现的:
[0007] 一种针对PRRS病毒Nsp9的纳米抗体的VHH链,包括框架区FR和互补决定区⑶R, 所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列:SEQIDNO:l所示的FR1,SEQIDNO:2所示 的FR2,SEQIDNO:3所示的FR3,SEQIDNO:4所示的FR4 ;所述互补决定区CDR选自下组 的CDR氨基酸序列:SEQIDNO: 5 所示的CDR1,SEQIDNO:6 所示的CDR2,SEQIDNO: 7 所 示的CDR3。
[0008] 所述的VHH链具有SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。
[0009] -种特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9纳米抗体,所述的纳米抗体来源于双 峰驼重链抗体可变区片段,可以特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9,具有权利要求1和 2所述的Nsp9纳米抗体的VHH链。
[0010] -种DNA序列,所述DNA序列编码所述的Nsp9纳米抗体的VHH链,或所述的纳米 抗体。
[0011] 所述的DNA序列具有SEQIDNO:9所示的核苷酸序列。
[0012] 一种表达载体,它含有所述的DNA序列。
[0013] 所述的表达载体可以在Marc-145细胞中表达纳米抗体-eGFP融合蛋白,并可以 抑制PRRS病毒在Marc-145细胞中的增殖。
[0014] 所述的表达载体,具有SEQIDNO: 10所示的核苷酸序列。
[0015] 所述的纳米抗体在制备用于治疗和防治PRRS药物中的应用。
[0016] 所述的DNA序列在开发抗PRRS转基因猪中的应用。
[0017] 本发明的有益效果为:
[0018] 本发明通过噬菌体展示技术筛选到了抗PRRS病毒非结构蛋白Nsp9特异性纳米抗 体。此纳米抗体可以特异性结合Nsp9,利用该纳米抗体的DNA序列构建真核表达载体,将其 导入Marc-145细胞,纳米抗体-eGFP以融合蛋白的形式在细胞中表达,并且具有抑制PRRS 病毒增殖的功能。该纳米抗体可以开发为治疗PRRS的药物,其基因序列可用于抗PRRS转 基因猪的研制。
【附图说明】
[0019] 图1是VHH基因电泳图;其中泳道1和2是PCR扩增重链抗体可变区基因片段,泳 道M是DNA分子标准。
[0020] 图2是ELISA实验鉴定Nsp9纳米抗体结果。
[0021] 图3是检测Marc-145细胞中表达的Nanobody-eGFP融合蛋白的WesternBlot 图。泳道1是Marc-145细胞,泳道2是转染了Nanobody-eGFP融合蛋白真核表达载体的 Marc-145细胞。图4不同PRRSV毒株接种细胞48小时后培养上清中子代病毒滴度(TCID5Q)。
【具体实施方式】
[0022] 本发明首先将Nsp9重组蛋白免疫一只阿拉善双峰驼,经过5次免疫之后分离该双 峰驼外周血淋巴细胞并构建了Nsp9特异的单域重链抗体文库。将可溶性Nsp9重组蛋白包 被在酶标板上,利用噬菌体展示技术筛选特异性结合Nsp9的纳米抗体基因库(骆驼重链抗 体噬菌体展示基因库),获得了Nsp9特异性纳米抗体。构建纳米抗体真核表达载体,将其导 入Marc-145细胞,胞质内表达的Nsp9纳米抗体可以高效地抑制PRRS病毒在Marc-145细 胞中的增殖。
[0023] 下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。
[0024] 实施例1 :针对于PRRS病毒非结构蛋白Nsp9的纳米抗体文库的构建:
[0025] (1)将5mlNsp9重组蛋白(lmg/ml)与弗氏佐剂等体积混合并乳化均匀,免疫一只 阿拉善双峰驼,每两周1次,共免疫5次,除第一次使用弗氏完全佐剂,剩余几次全部使用弗 式不全佐剂。(2) 4次免疫结束后,提取骆驼外周血淋巴细胞并提取总RNA,参照QIAGENRNA 提取试剂盒说明书操作。(3)按照InvitrogenSuperscript?III第一链合成系统试剂 盒说明书,将提取的RNA反转录成cDNA并利用套式PCR扩增VHH链,第一轮PCR:
[0026]上游引物:GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
[0027]下游引物:GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
[0028] 扩增重链抗体信
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